PREPARATION AND CYTOLYTIC TUMOR ACTIVITY OF OSTEOSARCOMA TUMOR INFILTRATING LYMPHOCYTES IN VITRO

In this study, the isolation, purification and differentiation of tumor-lnflltratlng lymphocytes (TIL) from 6 fresh osteosarcoma specimens were achieved by discontinuous density gradient centrifugation. One specimen of the osteosarcoma TIL were enlarged in IL-2 for long time in vitro, reaching 28 days and their cytolytic activity against different tumor cell lines was Investigated. The experimental results indicated that the preparation of osteosarcoma TIL adopted by the mechanical means was simple, having higher purifity, keeping higher effects on killing NK- sensitive tumor cell lines and NK-insensitive tumor cell lines as well as rapid proliferation in vitro cultured in IL-2.

恶性胸/腹水肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)体外选择性CD8+T细胞扩增的培养体系建立及功能表型分析

目的探讨体外恶性胸/腹水中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)大量培养扩增方法并初步研究其分子表型及功能特征.方法无菌操作条件下抽取恶性肿瘤患者胸/腹水,密度梯度离心法分离淋巴细胞,采用γ干扰素(IFN-γ)、抗CD3多克隆抗体OKT3和白细胞介素2(IL-2)为基础的联合方案扩增TIL,并记录其细胞形态及扩增速度.采用流式细胞术动态检测扩增淋巴细胞的分子表型T淋巴细胞亚群中淋巴细胞激活信号分子F7(SLAMF7)、CD45RO、颗粒酶B(GZMB)、程序性死亡蛋白1(PD-1)、CD57阳性细胞比例,CCK-8法检测其对肿瘤的杀伤能力.结果在本培养方案中,TIL细胞培养至第26天状态良好,第30天开始增殖速率下降.CD4^(-)CD8^(+)T细胞及CD8^(+)CD56^(+)T细胞比例随培养时间的延长逐渐提高,CD4^(+)CD8^(-)T细胞的比例逐渐下降,CD4^(+)CD25^(+)T细胞始终保持低水平状态.与扩增前相比,SLAMF7、CD45RO、GZMB、PD-1阳性细胞比例均有显著提高,耗竭性T细胞标志CD57表达比例也逐渐升高.TIL源性扩增性T细胞杀伤肿瘤细胞能力明显强于外周血单个核细胞(PBMC)源性,当效靶比为10∶1时杀伤能力最强,且杀伤能力在肿瘤细胞类型间存在明显差异.结论建立了从癌性胸/腹水中大量扩增TIL的培养方案,方法简便易行、效率高、杀伤肿瘤能力强,其效应细胞主要为CD8^(+)T细胞,表型处于活化状态.

PD-L1表达、CD8^(+)TIL密度与食管鳞癌临床病理特征及预后的关系

目的 探讨新疆莎车县维吾尔族食管鳞状细胞癌(ESCC)患者程序性死亡-配体1 (PD-L1)表达和CD8阳性肿瘤浸润淋巴细胞(CD8^(+)TIL)密度与临床病理特征及预后的关系。方法 收集2016年6月至2021年6月期间新疆莎车县人民医院收治的167例ESCC患者的组织蜡块。ESCC根治标本制备组织芯片,采用χ^(2)检验分析PD-L1表达、CD8^(+)TIL密度与临床病理特征的关系;Kaplan-Meier法分析PD-L1表达、CD8^(+)TIL密度与患者总生存期(OS)的关系,并绘制生存曲线图;单因素和多因素COX比例风险模型回归分析和OS相关的危险因素;Kaplan-Meier法分析PD-L1表达和CD8^(+)TIL密度不同亚组与OS的关系。结果 PD-L1表达在不同肿瘤浸润深度组间比较差异有统计学意义(P<0.05),PD-L1高表达组易发生深部浸润;CD8^(+)TIL密度在有无淋巴结转移组间比较差异有统计学意义(P<0.05),CD8^(+)TIL低密度组易发生淋巴结转移;PD-L1表达在不同CD8^(+)TIL密度组间比较差异有统计学意义(P<0.05),PD-L1高表达组CD8^(+)TIL密度较高;Kaplan Meier单因素生存分析结果显示,PD-L1低表达或CD8^(+)TIL高密度组预后较好;单因素COX回归分析结果显示,女性、PD-L1低表达或CD8^(+)TIL高密度组患者预后较好(P<0.05);多因素COX回归分析结果显示,PD-L1表达和CD8^(+)TIL密度是预测ESCC预后的有效指标(P<0.05);Kaplan Meier单因素分析结果显示,各亚组间,PD-L1低表达/CD8^(+)TIL高密度亚组预后最好,PD-L1高表达/,CD8^(+)TIL低密度亚组预后最差。结论 PD-L1表达和CD8^(+)TIL密度可以作为判断ESCC患者预后的有效标志物,联合使用抗血管生成药物和免疫检查点抑制剂,可能为某些免疫治疗预后较差的亚组提供新的治疗手段。

TIL与顺铂治疗恶性胸腔积液的疗效比较

目的观察肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)与顺铂治疗恶性胸腔积液的疗效。方法 40例患者随机选取20例为试验组、对照组,从恶性肿瘤胸腔积液的肿瘤细胞中分离得到TIL,并经10%人AB血清RPMI-1640液培养,经rIL-2体外激活培养,随后胸腔注射;对照组抽取胸腔积液后用顺铂胸腔注射。结果试验组完全缓解8例(40%),有效10例(50%),无效2例(10%),总有效率90%(18/20);对照组完全缓解7例(35%),有效9例(45%),无效4例(20%),总有效率80%(16/20)。两者疗效无统计学意义(P>0.05)。不良反应轻。结论 TIL治疗恶性胸腔积液疗效好,毒副作用小,能改善患者的生活质量。

三级淋巴结构对非小细胞肺癌患者新辅助治疗后病理反应及预后的影响

目的:研究三级淋巴结构(tertiary lymphoid structures,TLS)对接受新辅助治疗非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者的病理反应及预后的影响。方法:回顾性收集2019年1月至2023年12月于天津市胸科医院接受新辅助治疗后行手术的NSCLC患者132例,分为新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy,NC)组40例和新辅助化疗联合免疫治疗(neoadjuvant chemotherapy combined with immunotherapy,NCI)组92例。通过H&E染色评估切片中残余肿瘤细胞(residual viable tumor,RVT)百分比和肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL),采用H&E染色和免疫组织化学染色方法评估TLS数量和成熟度,分析两组中TLS数量和成熟度的差异以及对患者病理反应和预后的影响。结果:NCI组中TIL浸润水平、TLS的总数量、成熟数量以及病理完全缓解(pathologic complete response,pCR)率、主要病理缓解(major pathologic response,MPR)率均明显高于NC组(均P<0.001)。多因素Logistic分析结果显示,成熟TLS数量和TIL浸润是NCI组患者病理反应的影响因素(P<0.05)。多元线性回归分析结果表明,在NC组中TIL低浸润是高RVT的危险因素;同时在NCI组中,成熟TLS数量低、TIL低浸润和治疗前N分期是高RVT的独立危险因素(均P<0.05)。多因素Cox回归分析结果显示成熟TLS数量(P=0.001)和TIL(P=0.009)是NCI组患者无病生存期(disease-free survival,DFS)的独立预测因子,并且生存分析显示NCI组中TLS高成熟和TIL高浸润患者的DFS显著优于低成熟和低浸润者(均P<0.001)。结论:TLS低成熟度和TIL低浸润与NSCLC患者不良的病理反应和较短的DFS有关,TLS成熟度和TIL可以作为接受NCI患者的病理反应和预后的预测指标。

肿瘤细胞和TIL对化疗药物敏感性的测定

目的：探讨 MTT法应用于肿瘤细胞化疗敏感性检测的意义 ,及化疗与肿瘤浸润淋巴细胞 (tumor infiltrating lymphocyte,TIL)过继免疫治疗的合理应用。方法：应用 MTT法检测肿瘤细胞对化疗药物的敏感性和化疗对 TIL的毒性。结果：肿瘤细胞和 TIL细胞数都与生成的甲 ? (formazan)的光密度 (OD)值呈线性正相关。肿瘤细胞对化疗药物的敏感性存在较大个体差异。 EADM与 DDP， DDP与 MMC联合化疗存在协同作用， EADM与 5 FU联合化疗存在拮抗作用。化疗药物对 TIL的毒性作用大于对肿瘤细胞的杀伤作用。结论： MTT法应用于肿瘤细胞化疗敏感性检测以指导临床个体化治疗，具有筛选敏感性化疗药物和避免非敏感性化疗对机体抗肿瘤免疫细胞毒性的双重积极意义。 TIL过继免疫治疗与化疗不宜同时应用。

三阴性乳腺癌组织中PD-1/PD-L1轴表达与TILs关系及临床病意义

目的探讨三阴性乳腺癌(TNBC)组织中PD-L1/PD-1轴的表达以及肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)与临床病理特征和预后的关系。方法选取2016年1月至2017年8月我院病理科保存的132例石蜡包埋的女性TNBC组织,采用HE染色分析TILs浸润密度,采用免疫组化染色和免疫组织荧光双染色技术检测PD-1、PD-L1在组织中的表达和TILs表型,并探讨PD-L1^(+)CD4^(+)TILs、PD-L1^(-)CD8^(+)TILs表达与TNBC临床病理特征和总生存(OS)的关系。结果PD-1主要分布于TILs的细胞膜和细胞质中,阳性表达率为44.70%(59/132),而PD-L1主要分布于肿瘤细胞和TILs的细胞膜和细胞质中,阳性表达率为58.33%(77/132)。TNBC组织中PD-L1表达与CD4^(+)TILs、CD8^(+)TILs均有关(P<0.05)。PD-L1^(+)CD4^(+)TILs表达率为86.10%(60/72),与肿瘤直径、TNM分期、淋巴管浸润有关(P<0.05);PD-L1^(-)CD8^(+)TILs表达率为69.12%(47/68),与肿瘤直径、组织学分级、TNM分期、淋巴管浸润和淋巴结转移有关(P<0.05)。不同PD-L1表达的TILs浸润表型与患者OS无关(χ^(2)=0.796,P=0.850;χ^(2)=3.733,P=0.292),多因素Cox风险比例回归模型分析,PD-L1^(-)CD8^(+)TILs浸润是影响TNBC患者OS的独立保护因素(HR=0.853,95%CI=0.659~0.998)。结论PD-L1^(-)CD8^(+)TILs浸润预示着较小的肿瘤直径、低组织学分级、低TNM分期、无淋巴管浸润和无淋巴结转移以及良好的生存预后,为PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂的研究提供新思路。

口腔癌TIL的提取、培养、表型分析及体外抗瘤活性研究

本文对９例口腔癌手术切除的原发灶肿瘤标本的ＴＩＬ进行了体外分离、培养、扩增、表型分析及ＮＫ和ＬＡＫ活性测定。其中８例扩增获得成功，扩增倍数为１０～１２００（平均４７２．２）倍。表型分析表明，扩增后的ＴＩＬ中ＣＤ，ＣＤ和ＣＤ均有增加，但以ＣＤ、ＣＤ为主。抗瘤活性在培养４周左右达最高峰；ＮＫ和ＬＡＫ活性分别为５２％和４４％。全部病例经肉汤培养基、沙氏培养基、支原体检测药盒及家兔发热试验未检测到细菌、真菌、支原体及热原质。本研究提示，口腔癌ＴＩＬ的临床应用是可行的。

口腔癌TIL的表型及细胞毒活性测定

作者在成功地建立了口腔癌TIL的分离、培养方法的基础上,采用单抗致敏的红细胞花环试验和H^3-TDR释放法,对10例口腔癌TIL的表型及功能特征进行了动态分析。结果发现新分离TIL中CD_3^+、CD_4^+、CD_8^+较低,体外培养后,TIL中各亚群均有增加,但以CD_3^+、CD_8^+增加为主;新分离TIL的NK和LAK活性分别为10％和10.5％,随体外培养时间延长,其细胞毒活性增强,在4周时达高峰。NK和LAK活性分别为50％和44.8％。4周后,其活性开始降低。提示口腔癌TIL的临床应用时机为培养4周左右。

口腔癌TIL的制备、检测及临床初步应用

运用Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ方法从１０例口腔癌原发灶瘤体中分离出ＴＩＬ，在ＲＰＭＩ１６４０中培养扩增，用肉汤培养基，沙保培养基，支原体检测药盒及家兔发热试验对ＴＩＬ进行细菌、真菌、支原体及热源质检测。同时，对３例晚期口腔癌患者，配合环磷酰胺进行自身ＴＩＬ回输治疗。结果表明，利用有限的口腔癌原发灶标本，能获得具有较强抗瘤活性的ＴＩＬ。经严格检测，未发现病源微生物及热源质。初步临床应用，无严重并发症；近期临床观察，有一例复发。研究提示，口腔癌ＴＩＬ的临床应用是安全可行的。

s-TIL对肝癌化疗栓塞后T淋巴细胞亚群的影响

目的 观察原发性肝癌化疗栓塞辅加冷冻肝癌瘤苗刺激的肿瘤浸润淋巴细胞 (s TIL)治疗前后外周血T淋巴细胞亚群的变化。方法 82例行化疗栓塞 (TACE)后的肝癌患者分为s TIL治疗组及对照组。 2组分别于TACE治疗前及治疗后 7天、14天、2 1天采外周静脉血检查T淋巴细胞亚群 ,2组进行比较。结果 治疗组CD+ 3 、CD+ 4、CD+ 8、CD+ 4/CD+ 8比值在 14天左右即上升 ,与对照组比较有显著性差异 (P <0 .0 5 )。结论 原发性肝癌TACE治疗后辅加s

半乳糖抗小鼠CD_3单克隆抗体的制备及其结合TIL后的趋肝性研究

报道以半乳糖为原料制得２－亚氨基－２－甲氧乙基－１－硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＭＥ）后，与抗小鼠ＣＤ３单克隆抗体共价偶联制得半乳糖抗小鼠ＣＤ３单克隆抗体，再与标记３Ｈ－ＴｄＲ的肿瘤浸润性淋巴细胞（ＴＩＬ）结合。经动物试验表明，复合物较单纯ＴＩＬ具有明显的趋肝性，且能较长时间地浓集于小鼠肝脏内，说明半乳糖抗小鼠ＣＤ３单克隆抗体可作为肝靶向载体将抗肿瘤药选择性地导向肝脏，可能为肝癌的生物导向治疗开辟了新的途径。

不同来源的TIL临床应用研究

以５１例晚期肿瘤患者作为研究对象，对其不同来源的肿瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ）进行治疗研究，发现肿瘤组织来源的ＴＩＬ其有效率及一年生存率明显高于胸腹水及转移淋巴结的ＴＡＬ；其中肿瘤组织的ＴＩＬ，胸腹水、转移淋巴结的ＴＡＬ有效率分别为８０．９％、４０．０％、４６．６％；三者治疗肿瘤患者的一年生存率分别为８１．０％、４６．７％、６０．０％；另外发现胸腹水ＴＡＬ对实质性肿块治疗疗效较低，为４０％，其中静脉滴注更差，为１４．２％，而介入注射与局部治疗较好，为６２．５％；胸腹水ＴＡＬ对癌性胸腹水有一定疗效，以胸腹腔注射为最佳注射途径，消退率为７４％，高于静脉滴注２８．５％；对胸腹水治疗后不消退者进行分析，可能与肿瘤患者的病情有关，影响了ＴＡＬ的吸收。提示治疗实质性肿瘤以ＴＩＬ效果较佳，而ＴＡＬ对胸腹水有一定疗效，且以胸腹腔注射为最佳治疗途径。

肝癌癌周组织淋巴细胞和TIL的分布及抗瘤活性的研究

目的 :研究肝癌癌周组织淋巴细胞和肝癌TIL的分布及抗瘤活性。方法 :用冷胶原酶消化分离法来分离肝癌癌周组织淋巴细胞及肝癌实质部和中心部TIL并测定它们的获得率。用3H -TdR释放法测定它们对自体肝癌细胞的杀伤活性。结果 :肝癌实质部TIL获得率最高 ,肝癌癌周组织淋巴细胞获得率次之 ,肝癌中心部TIL获得率最低。它们对自体肝癌细胞的杀伤活性从高到低则分别为肝癌实质部TIL、肝癌中心部TIL和肝癌癌周组织淋巴细胞。结论 :肝癌癌周组织和肝癌组织不同部位的淋巴细胞分布有所不同。它们的抗瘤活性也各不相同。为了获得数量多和抗瘤活性高的淋巴细胞 。

不同取材部位的TIL得率及活力研究

为了获得更多、活力更强的ＴＩＬ细胞，本实验就实体瘤肝癌、肺癌及卵巢癌取材部位进行了分析，比较了取自肝癌、肺癌组织的浸润结节、交界组织、实质部位、中心及坏死区域的得率与活力，结果发现：坏死部位的细胞得率与活力最差，淋巴细胞得率也最差，肝癌、肺癌组织分别为４．０５×１０￣４／ｇ、５．５×１０￣４／ｇ；中心部位较差，分别为３．６×１０￣５／ｇ、４．１９×１０￣５／ｇ；实质部位的细胞得率最高，淋巴细胞得率最多，肝癌、肺癌组织分别为１．５９８×１０￣６／ｇ，９．０５×１０￣５／ｇ；表面浸润结节及交界组织淋巴细胞得率及活力较好，在肺癌组织分别为７．８７×１０￣５／ｇ、７．０４×１０￣５／ｇ，在肝癌组织分别为８．４×１０￣／ｇ、１．２２９×１０￣／ｇ，故认为肝癌、肺癌组织以浸润结节、交界组织及实质部分较好。对于卵巢癌肿块，分析其浸润结节、实质部位及卵泡部位，其中表面浸润结节最后为７．２４７×１０￣５／ｇ，其次为实质部位为２．４９９×１０￣５／ｇ，而卵巢组织最差为２．０１７×１０￣５／ｇ，故认为卵巢肿瘤的取材以表面浸润结节为最好。

细胞凋亡荧光染色法在检测TIL细胞毒效应中的应用

细胞毒细胞杀伤肿瘤细胞主要通过细胞凋亡机制。用传统的MTT法探讨了肿瘤浸润淋巴细胞TIL细胞杀伤活性最佳条件，同时采用凋亡荧光染色法（AFS）检测TIL的生物学效应。结果发现AFS法比MTT法更能准确地反映TIL对靶细胞的杀伤，杀伤率与效靶比呈良好的线性关系（r=0．89）；且该法简便、快速、敏感、重复性好，能同时观察活细胞、凋亡及坏死三种细胞的形态特征。

双歧杆菌协同TIL细胞体内杀瘤活性的研究

本研究应用从小鼠Ｓ１８０癌性腹水分离诱导的ＴＬ瘤内注射与活的双歧杆菌腹腔内注射共同治疗荷Ｓ１８０实体瘤小鼠，结果表明单用ＴＩＬ和ＴＩＬ合用ＩＬ－２早期抑瘤效果，能延缓肿瘤的发生和发展，而晚期抑瘤效果尚不及单用双歧杆菌组。ＴＩＬ与双歧杆菌、ＴＩＬ、双歧杆菌及低剂量ＩＬ－２，荷瘤早、晚期抑瘤效果均较好，且毒副作用低，表明双歧杆菌有可能通过刺激机体产生内源性ＩＬ－２维持ＴＩＬ的生物学活性从而协同ＴＩＬ细胞在体内的杀瘤作用。本研究亦表明ＴＩＬ中以ＣＤ＋细胞为主，杀瘤活性有一定的ＭＨＣ限制。

肺癌TIL抗瘤活性、表型分析及临床应用的初步观察

目的 从肺癌患者手术切除的肿瘤组织中分离出肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) ,经rIL 2体外激活培养 ,研究TIL对瘤细胞的杀伤活性及其表型变化 ,并对其回输后的毒副反应及患者免疫功能变化进行了观察。方法 从 5 1例肺癌患者手术切除的实体瘤中分离得到TIL ,并经 10 %人AB血清RPMI 16 40液培养。 12例在培养前、后应用 3H TdR释放实验测定TIL对自体瘤细胞和 80 1 D细胞的杀伤作用 ,13例用间接免疫荧光法测定了淋巴细胞表型CD3+ 、CD4+ 、CD8+ 比例的变化。 15例患者静脉输注了活化的自体TIL。结果 TIL在培养第 2 5天左右对自体瘤细胞和 80 1 D细胞的杀伤力比培养当天有显著性提高 ;淋巴细胞表型分析示CD3+ 、CD8+ 比例在培养过程中有明显提高 ,而CD4+ 比例和CD4+ /CD8+ 比值变化不大 ;自体回输的 15例患者一般状况好 ,无明显毒副反应 ,辅助检查无异常改变 ,免疫功能增强 ,复查血尿常规、生化、心肺功能等均无异常改变 ,远期疗效正在观察中。结论 大部分病例短期即可回输TIL ,且毒副反应小 ,因此肺癌TIIL过继免疫治疗是一种值得在临床进一步研究的免疫治疗方法。

TIL抗肿瘤免疫疗法的临床疗效观察

以ＩＬ－２激活的肿瘤浸润性淋巴细胞（ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＴＩＬ），治疗多种晚期恶性肿瘤共１６例。结果表明，多数患者自觉症状有改善，生活质量提高，部分患者的癌性症状改善明显，１６例患者中，ＰＲ９例（３７．５％），ＮＣ７例（４３．７％），ＰＤ３例（１８．７５％）。ＴＩＬ作为一种新的生物治疗方法，其临床抗肿瘤疗效是肯定的，具有一定的临床应用价值。

肿瘤浸润淋巴细胞在三阴性乳腺癌新辅助化疗预测价值中的研究进展

三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是一种具有高度侵袭性特征的乳腺癌,总体预后不良。肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)在肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)中发挥重要作用,可通过细胞免疫调节作用起到对肿瘤细胞增进或抑制。新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy,NAC)是TNBC常见的且有效的治疗手段,其可以通过缩小原发肿瘤达到降期保乳、保腋窝或使“不可手术乳腺癌”转变为“可手术乳腺癌”,为患者治疗提供更多可选的临床思路。目前,TNBC的NAC疗效及预后的预测价值是临床研究的重点和难点,肿瘤浸润淋巴细胞作为重要的生物免疫标志物,在这方面具有较为重要的意义。本文将对TILs在TNBC的NAC疗效及预后方面的预测价值进行综述。