Tumstatin肽对视网膜微血管内皮细胞迁移及P38MAPK蛋白表达的影响

目的:观察tumstatin肽对体外培养的视网膜微血管内皮细胞迁移及P38MAPK蛋白表达的影响,初步探讨tumstatin肽抗视网膜内皮细胞迁移的机制。方法:采用细胞划痕实验测定tumstatin肽(T8肽)对血管内皮生长因子(VEGF)诱导下RF/6A细胞(恒河猴视网膜微血管内皮细胞)迁移的影响;Western blotting检测T8肽对VEGF刺激后15,30,45,60min的RF/6A细胞P38MAPK蛋白水平的变化。结果:Tumstatin肽对RF/6A细胞迁移具有抑制作用,且可抑制VEGF对RF/6A细胞的促迁移作用,呈剂量依赖性。正常情况下,RF/6A细胞无P38MAPK蛋白的表达,但VEGF可诱导其表达P38MAPK蛋白,而tumstatin可抑制VEGF诱导的RF/6A细胞P38MAPK蛋白的表达(加入20mg/LT8肽30,45,60min时蛋白表达受到显著抑制,差异有显著性意义,P<0.01)。结论:Tumstatin抑制视网膜微血管内皮细胞的迁移,其作用可能与P38MAPK通路有关。

Tumstatin肽对视网膜微血管内皮细胞增殖及ERK蛋白表达的影响

目的观察Tumstatin肽对体外培养的视网膜微血管内皮细胞增殖及细胞外信号调节激酶(ERK)蛋白表达的影响。方法采用MTT比色法测定Tumstatin肽(T8肽)对血管内皮生长因子(VEGF)诱导下的恒河猴视网膜血管内皮细胞(RF/6A细胞)增殖的干预作用;采用Western-blot检测T8肽对VEGF刺激后15,30,45,60min的RF/6A细胞ERK1/2蛋白表达水平的变化。结果T8肽浓度在5μg/ml以上时对RF/6A细胞有抑制作用,且抑制作用随着浓度的增大而增高,各组A值和抑制率比较差异均有显著性(均P<0.05);T8肽可抑制VEGF对RF/6A细胞的促增殖作用;在1～40μg/ml相同浓度条件下,T8肽对VEGF条件下的RF/6A细胞增殖抑制率显著大于无VEGF条件下的抑制率(均P<0.01)。VEGF可刺激RF/6A细胞ERK1/2蛋白表达增加,T8肽可抑制VEGF诱导的RF/6A细胞ERK1/2蛋白的表达。结论Tumstatin抑制视网膜微血管内皮细胞的增殖,机制可能与VEGF信号转导通路上的ERK1/2细胞信号转导通路有关。

Tumstatin肽对条件培养基下视网膜脉络膜血管内皮细胞迁移的影响

目的模拟糖尿病视网膜病变(DR)的体内环境,观察血管形成抑制因子Tumstatin肽(T8肽)对高糖视网膜M櫣ller细胞条件培养基(HGMCM)诱导的视网膜脉络膜血管内皮细胞迁移的影响。方法采用细胞划痕实验,观察不同质量浓度的T8肽对HGMCM诱导的RF/6A细胞迁移的抑制作用。结果加入不同质量浓度的T8肽后,RF/6A细胞24 h、48 h迁移的距离显著降低,迁移距离随着T8肽质量浓度的增大而逐渐降低(P<0.01)。结论Tumstatin肽能够抑制HGMCM诱导的视网膜脉络膜血管内皮细胞迁移,可能是Tumstatin肽抗血管生成的机制之一。

血管形成抑制因子tumstatin_(45-132)的基因克隆、表达和生物学活性

目的: 克隆人tumstatin全长编码区基因及编码tum statin45-132的基因, 在大肠杆菌中表达。方法: 采用RT PCR从人胚肾细胞系 293细胞中克隆人的tumstatin全长编码基因, 继以PCR扩增tumstatin45-132 (45 -132位氨基酸 )编码基因, PCR产物克隆到pBV220载体中, 测序证实后, 转化E.coliBL21, 于 42℃进行热诱导表达。用SDS -PAGE分析表达产物, 对重组蛋白纯化后用内皮细胞增殖试验测定其生物学活性。结果: RT- PCR扩增出tumstatin全长编码基因, 以PCR扩增出tumstatin45-132的编码基因, 经序列分析证实与GenBank中的序列完全一致。以含有tumstatin45-132编码基因的表达载体转化E.coliBL21后, 可表达出相对分子质量(Mr)为 9 600的重组蛋白。表达产物的蛋白量占菌体蛋白量的 10%, 纯化后能抑制内皮细胞的增殖。结论: 成功克隆全长tumstatincDNA, 并在大肠杆菌中表达重组tumstatin45-132蛋白, 证实其具有抑制内皮细胞增殖的活性。

Tumstatin治疗喉鳞癌的实验研究

目的探讨肿瘤抑素(Tumstatin)对喉鳞癌细胞(Hep-2)的治疗作用。方法用Hep-2细胞株进行传代培养,台盼蓝法观察Tumstatin和顺铂对不同培养时间细胞的生长抑制情况;MTT法检测不同浓度的Tumstatin对Hep-2细胞存活率的影响,光镜观察细胞形态的变化;电镜和3′-原位末端标记法(TUNEL)检测Hep-2细胞凋亡的发生和形态学改变。结果①随着药物对Hep-2细胞作用时间的延长,细胞生存率明显降低,存在时间依赖性;②MTT检测显示,Tumstatin对细胞的增殖的抑制效应具有剂量依赖性;③光镜观察发现,药物作用组细胞出现病变;④电镜和TUNEL染色证实,Tumstatin对Hep-2细胞的抑制作用是以促进细胞凋亡为主。结论Tumstatin可能通过促进细胞凋亡发挥抗肿瘤的作用。

tumstatin基因修饰的CD34^+造血干细胞生成抗血管生成活性的血小板

目的以慢病毒为基因载体,将tumstatin cDNA导入CD34+造血干细胞,在体外诱导生成tumstatin基因修饰的巨核细胞(MKs)和血小板,检测产生的血小板对血管内皮细胞管状结构形成的作用。方法构建pLVX-tumstatin-mCMVZsGreen重组载体后转染293T细胞进行病毒包装。用密度梯度离心法结合免疫磁珠分离法富集脐血中CD34+造血干细胞。用慢病毒感染CD34+造血干细胞,在细胞因子组合培养液中诱导MKs生成,流式细胞仪和形态学检测MKs的生成及产血小板情况。应用RT-PCR法和Western blot法检测tumstatin基因的表达,通过人脐静脉血管内皮细胞管状结构形成抑制试验研究血小板内容物生物学活性。结果选择最佳感染复数(MOI)30∶1感染干细胞时效率最高;流式细胞术检测结果显示,细胞在诱导过程中,转染组与未转染组细胞都有MKs与血小板的生成,且生长速度和分化趋势基本相同。在转染的MKs基因组里,RT-PCR法检测到738bp tumstatin基因片段。Western blot法检测到tumstatin在转基因细胞来源的血小板中稳定表达,血小板可明显抑制人脐静脉内皮细胞管状结构形成。结论基因修饰的CD34+造血干细胞在体外成功诱导分化为MKs和血小板并表达tumstatin蛋白,且这种血小板在体外显著抑制人脐静脉血管内皮细胞的管状结构形成。

人Tumstatin在毕赤酵母中的表达和活性分析

利用PCR技术从重组质粒pET-3c-tum中扩增人tumstatin的cDNA片段,连入pPICZαA酵母表达载体,获得的重组质粒pPICZα-tum电激法转化毕赤酵母GS115。经表型鉴定、诱导表达筛选,得到可分泌表达人tumstatin的重组酵母转化子,表达蛋白质的相对分子量约30kD,表达量约25mg/L。表达上清经超滤浓缩和离子交换法初步纯化,所得产物具有免疫活性,能够抑制内皮细胞增殖,诱导其发生细胞凋亡,并能抑制鸡胚尿囊膜血管生成。

Tumstatin肽对视网膜微血管内皮细胞增生和迁移的影响

目的探讨Tumstatin肽对视网膜血管内皮细胞增生和迁移的影响,了解其抑制血管生成的途径。方法采用MTT比色法观察1mg·L-1、5mg·L-1、10mg·L-1、20mg.L-1和40mg·L-1的Tumstatin肽(T8肽)对恒河猴视网膜血管内皮细胞(RF/6A细胞)增生的影响;采用流式细胞仪检测20mg·L-1的T8肽对RF/6A细胞细胞周期的影响;采用划痕修复实验观察0mg·L-1、5mg·L-1、10mg·L-1和20mg·L-1的T8肽对RF/6A细胞迁移的影响。结果5mg·L-1以上浓度的T8肽对RF/6A细胞增生有抑制作用且呈剂量依赖性,1mg·L-1、5mg.L-1、10mg·L-1、20mg·L-1和40mg·L-1浓度的T8肽抑制率分别为(2.69±1.10)%、(6.58±1.91)%、(16.77±3.05)%、(31.60±7.57)%和(40.05±8.43)%,各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。未加入T8肽时,RF/6A处于G0～G1期、S期和G2～M期的细胞比例分别为(43.66±1.37)%、(44.13±0.99)%和(12.21±0.39)%,而加入20mg·L-1的T8肽后则分别为(55.27±0.63)%、(28.51±0.68)%和(16.23±1.00)%,细胞凋亡率也由原来的0增加到(7.18±0.25)%,2组比较差异有显著统计学意义(P<0.01)。培养基中加入0mg·L-1、5mg·L-1、10mg·L-1和20mg·L-1的T8肽后RF/6A细胞24h的迁移距离分别为(248.09±2.28)μm、(175.27±3.22)μm、(120.81±3.59)μm和(44.65±1.83)μm,而48h时则为(393.68±2.21)μm、(341.62±4.27)μm、(254.65±2.93)μm和(118.69±5.96)μm,在同一时段,各组比较差异均有显著统计学意义(P<0.01)。结论T8肽能够抑制RF/6A细胞的增生和迁移,使细胞阻滞于G0～G1期及诱导细胞凋亡是其抑制RF/6A细胞生长的原因。

肿瘤血管生成抑制因子tumstatin的研究进展

肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成,通过抑制血管生成而切断肿瘤营养供给的方法一直是肿瘤生物治疗的研究热点。内源性新生血管抑制剂靶向性治疗肿瘤具有不产生耐药性、无毒副作用以及广谱性,故应用前景良好。肿瘤抑素(tumstatin)是最新发现的来源于基底膜Ⅳ型胶原的肿瘤血管生成的内源性抑制因子。本文就tumstatin在肿瘤生长、转移中的作用,及在肿瘤诊断研究中的意义、抗肿瘤血管生成基因治疗研究中的进展进行综述。

人tumstatin基因的克隆表达及其鉴定

目的重组表达人tumstatin,为人tumstatin的肿瘤受体显像奠定基础。方法提取HEK293细胞总RNA,通过RT-PCR扩增人tumstatin基因,导入pMD19-T,测序,然后亚克隆至pET28a,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定。结果提取的总RNA经电泳,有清晰的28S和18S两条带。RT-PCR扩增产物长度与理论值750bp相一致。测序证实tumstatin基因正确插入载体中。重组人tumstatin在大肠杆菌中高效表达,表达量约占菌体总蛋白量的30%。Western blot证实所表达蛋白为目的蛋白。结论重组人tumstatin蛋白在大肠杆菌中高效表达,为进一步的tumstatin的肿瘤受体显像奠定基础。

重组人tumstatin的原核生物表达和多克隆抗体制备

目的原核生物表达可溶性的tumstatin抗原并制备相应的多克隆抗体。方法利用原核表达载体pMAL-tumstatin在大肠埃希菌BL21中表达tumstatin,经Amylose Resin亲和层析柱和Q Sepharose Fast Flow柱纯化tumstatin,以纯化蛋白免疫新西兰兔,获得抗tumstatin多克隆抗体。利用western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。结果tumstatin蛋白表达成功。SDS-PAGE分析表明其为可溶性表达。成功获得了tumstatin纯品及兔抗tumstatin多克隆抗体。ELISA法表明多克隆抗体效价>5 000。western blot检测证明多克隆抗体的特异性良好。结论成功表达、纯化tumstatin蛋白,并获得高特异性、高效价兔抗tumstatin多克隆抗体,为其在临床免疫学检测应用奠定了基础。

Tumstatin_(183-230)-TRAIL融合蛋白的克隆表达及其生物学双功能鉴定

目的:克隆表达融合蛋白Tumstatin_(183-230)-TRAIL,并观察其生物学功能。方法:利用重组PCR技术扩增Tumsta- tin_(183-230)-TRAIL(Tu-T)的融合编码序列.构建pMAL—Tu—T融合蛋白表达载体,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,得到MBP—Tu—T融合蛋白.用SDS-PAGE鉴定纯化的表达产物。通过体外内皮细胞增殖抑制实验、肿瘤细胞杀伤实验、体外管腔形成抑制试验及电镜检测细胞凋亡情况对其生物学双功能进行鉴定。结果:融合蛋白MBP—Tu—T在BL21中表达率约20%.可明显抑制内皮细胞增殖(IC_(50)12.5μg/ml),杀伤、诱导胰腺癌细胞凋亡并抑制体外管腔形成。结论:融合蛋白MBP-Tu-T具有双功能生物学活性,为进一步研究其靶向性杀伤肿瘤奠定了基础。

Tumstatin基因抗肿瘤血管生成片段Tum-5的研究进展

本文就肿瘤抑素(Tumstatin)抗血管生成活性片段Tum-5的相关研究进展做一综述。

Tumstatin转基因巨核细胞在NOD/SCID鼠体内产生抗新生血管作用血小板

目的了解tumstatin转基因巨核细胞在非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)鼠体内生成血小板情况及其抗新生血管作用。方法制备的tumstatin转基因巨核细胞注入NOD/SCID鼠体内,定期取血,通过流式细胞仪分析转基因血小板产生情况;激光共聚焦法检测血小板的tumstatin表达;内皮细胞管状结构形成试验检测血小板的抗血管生成作用;血小板聚集试验检测转基因血小板的聚集功能。结果 tumstatin转基因巨核细胞输注NOD/SCID鼠后的第3天,外周血可检测到人血小板;血小板表达tumstatin;这种转基因血小板可显著抑制内皮细胞管状结构形成并保持正常的聚集功能。结论 tumstatin转基因巨核细胞可在NOD/SCID鼠体内产生有抑制血管形成且保持正常聚集功能的血小板,为进一步抗肿瘤研究奠定基础。

Tumstatin:特异性内皮细胞蛋白合成抑制剂

研究已经证实无论是实体瘤还是血液系肿瘤的生长和转移都是血管依赖性的。肿瘤组织的血管新生主要取决于内皮细胞的增殖和凋亡间的平衡。新近发现的具有肿瘤抑制性的组织内源性的Tumstatin ,还具有特异性内皮细胞蛋白质翻译合成抑制作用 。

新型内源性血管生成抑制剂Tumstatin

内源性血管生成抑制剂是抗血管生成治疗最有潜力的药物蛋白。Tumstatin是最近发现的一种新型高效的内源性血管生成抑制剂 ,可特异性地作用于内皮细胞 ,诱导内皮细胞凋亡 ,起到抗血管生成作用。

rAV-Tumstatin病毒载体构建及其生物活性检测

目的:探讨腺病毒携带肿瘤抑素(rAV-Tumstatin)对人膀胱癌T24细胞株的影响与作用,为进一步研究其作用机制提供实验依据。方法:构建rAV-Tumstatin并感染人膀胱癌T24细胞株,将细胞分为rAV-Tumstatin组、rAV-MCS空病毒组和空白对照组,采用噻唑蓝(MTT)比色法和原位末端标记(TUNEL)法分别检测感染细胞的增殖和凋亡情况。结果:rAV-Tumstatin既可以稳定感染T24细胞也可以在该细胞内表达携带的外源基因EGFP。TUNEL法检测,rAV-Tumstatin组细胞凋亡率为32.9%,rAV-MCS空病毒组和空白对照组分别为13.5%和6.7%,3组间比较差异均有显著性(P<0.01)。MTT比色法检测T24细胞株的增殖生长能力,rAV-Tumstatin组G0/G1期60.3%,S期17.4%,G2/M期21.5%;空病毒组G0/G1期45.2%,S期29.5%,G2/M期24.8%;对照组G0/G1期43.7%,S期32.8%,G2/M期23.7%。3组间各细胞周期细胞增殖率比较差异有显著性(P<0.05)。结论:rAV-Tumstatin能抑制膀胱癌T24细胞株增殖并诱导其凋亡,对膀胱癌基因治疗的研究具有一定的价值。

外周血VEGF与Tumstatin检测在非小细胞肺癌进展中的应用价值

目的探讨外周血肿瘤抑素(Tumstatin)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)检测在非小细胞肺癌进展中的临床应用价值。方法使用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测24例为非小细胞肺癌患者及24例健康体检者的血小板与血清Tumstatin、VEGF的水平。运用免疫组化法检测24例肺癌石蜡切片中微血管密度(MVD)的表达。结果血小板、血清Tumstatin水平在肺癌恶性进展中降低,血小板、血清VEGF水平以及肺癌组织中MVD在肺癌恶性进展中升高;血小板、血清Tumstatin在肺癌淋巴结转移组与肺癌病灶有坏死组中的水平分别低于肺癌无淋巴结转移组、肺癌病灶无坏死组(P<0.05),而血小板、血清VEGF在肺癌淋巴结转移组与肺癌病灶有坏死组中的水平分别高于肺癌无淋巴结转移组与肺癌病灶无坏死组(P<0.05);MVD计数在肺癌有淋巴结转移组中的水平高于肺癌无淋巴结转移组(P<0.05),但在肺癌病灶有坏死组与肺癌病灶无坏死组间差异无统计学意义。结论外周血Tumstatin与VEGF之间的平衡关系对肺癌的血管生成可能起重要的调节作用;外周血血管形成调节因子的水平与肿瘤组织MVD密切相关,对非小细胞肺癌的病情进展起到很好的监测作用。

肿瘤血管内皮抑素tumstatin腺相关病毒载体的构建及其功能的初步鉴定

目的:探讨腺相关病毒(rAAV)-肿瘤内皮抑素(tumstatin)(简称rAAV-Tum)载体的构建及其生物学效应的初步鉴定。方法:用PCR扩增tumstatin序列至pAAV-MCS载体,构建pAAV-Tum;采用AAV-Helper Free System包装系统、"氯仿-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提"及冰乙醇沉淀法进行AAV的包装、纯化和浓缩;用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对rAAV-Tum生物学效应进行初步鉴定。结果:成功构建pAAV-Tum载体,并经酶切、PCR及测序证实;rAAV病毒颗粒滴度达2×1010v.p/mL,浓缩后可达到2×1011～12v.p/mL;rAAV-Tum可以分泌内皮抑素,诱导HUVEC凋亡。结论:成功构建rAAV-Tum腺相关病毒,体外实验表明该病毒能高效诱导内皮细胞的凋亡。

人肿瘤抑素(Tumstatin)在E.coli中的克隆、表达及活性分析

从人胚肾2 93细胞中扩增肿瘤抑素(tumstatin)基因,进行原核表达,纯化和生物活性检测.利用原核表达载体pMAL c2在大肠杆菌BL2 1中表达肿瘤抑素,经AmyloseResin亲和层析柱和QSepharoseFastFlow柱纯化,通过体外内皮细胞增殖、内皮细胞凋亡和鸡尿囊绒膜新生血管生成试验检测其抑制活性.MBP tumstatin在BL2 1中表达率约2 0 % ,肿瘤抑素纯度可达95 % .肿瘤抑素可明显抑制内皮细胞增殖(IC50 约为15 μg ml)、诱导内皮细胞凋亡和抑制鸡尿囊绒膜新生血管生成.研究结果表明,肿瘤抑素对内皮细胞具有明显的抑制作用,提示其在肿瘤治疗中有潜在的应用前景.