磷脂酶C特异性抑制剂U-73122对玉米大斑病菌分生孢子萌发及毒素活性的影响

磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)通过降解细胞膜上的磷脂分子产生IP3和DAG两个第二信使分子,分别激活下游的Ca2+途径和蛋白激酶C。研究表明,PLC与植物病原真菌的致病及发育过程有关。利用PLC特异性抑制剂U-73122初步研究了玉米大斑病菌PLC的功能。结果显示,U-73122对玉米大斑病菌菌丝生长及分生孢子的萌发均具有明显的抑制作用,且抑制率随抑制剂浓度升高而增强;并且可引起芽管的缩短和不规则膨大。此外,U-73122也可以导致病菌粗毒素的生物学活性明显降低。由此说明PLC可以通过影响菌丝及芽管的极性生长,而调控玉米大斑病菌的菌丝及分生孢子发育;同时参与病菌的毒素合成。

U73122和三氟吡啦嗪对柴胡皂甙(I)促胰腺腺泡酶分泌的影响

应用碘淀粉比色法检测淀粉酶活性技术 ,以卡巴可 ( CCh)及八肽胆囊收缩素 ( CCk-8)为阳性对照药 ,研究了磷脂酶 C( PLC)抑制剂 U731 2 2和钙调素 ( Ca M)抑制剂三氟吡啦嗪 ( trifluoperazine)影响柴胡皂甙 ( I) [SA( I) ]刺激大鼠胰腺腺泡酶分泌的剂量依赖性和分泌动力学特征 .U731 2 2抑制 SA( I)和 CCh促酶分泌有相似的剂量依赖性 ,1 0 - 5mol·L- 1 U731 2 2分别抑制了相同浓度 SA( I)和 CCh作用的 5 7.4 %和 6 1 .5 % .U731 2 2抑制 SA( I)促酶分泌动力学较对 CCh的抑制缓慢且持续时间较长 .trifluoperazine抑制 SA( I)促酶分泌与对 CCk-8的抑制有相似的剂量依赖性 ,高浓度对 SA( I)作用的抑制更显著 .结果表明 ,SA( I)活化 PLC和 Ca

U73122和SQ22536对豚鼠视网膜色素上皮细胞分泌bFGF的影响

目的:观察磷脂酶C抑制剂U73122和腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536对豚鼠视网膜色素上皮(RPE)细胞分泌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的影响。方法:培养原代豚鼠RPE细胞,传2代后用于实验。用含U73122及SQ22536浓度均为1×10-5mol/L的两种培养液培养RPE细胞,设含有单纯溶质的培养液作为对照。分别于实验2、4、6、8、16、24、48 h收集培养液,ELISA法检测bFGF的含量。结果:ELISA结果显示:加入1×10-5mol/L U73122后,实验组bFGF的分泌量与对照组相比在2、4、6、8、16h减少(P<0.05),24、48 h变化无统计意义(P>0.05);而SQ22536组与对照组相比RPE细胞bFGF的分泌量在各时间点均有减少(P<0.05)。结论:U73122和SQ22536对RPE细胞bFGF的分泌均有抑制作用。提示RPE细胞内可能是通过磷脂酶C信号途径和腺苷酸环化酶信号途径共同调控bFGF的分泌。

磷脂酶C抑制剂U73122对COPD大鼠肺组织内MMP-9,MMP-12表达影响的实验研究

目的:探讨磷脂酶C抑制剂U73122对COPD大鼠肺组织内MMP-9,MMP-12表达的影响。方法:通过烟熏及气管内注入脂多糖(LPS)建立COPD大鼠模型,从第1d起通过尾静脉注射磷脂酶C(PLC)抑制剂U73122(以U73343为阴性对照),持续28天。第28d,观察各组大鼠肺组织病理变化,western blot法检测肺组织中MMP-9、MMP-12表达水平。结果:模型组和干预组大鼠MMP-9、MMP-12蛋白表达高于对照组(P<0.05),干预组低于模型组(P<0.05)。干预组肺组织形态学改变较模型组改善(P<0.05)。结论:U73122通过抑制磷脂酶C(PLC)信号途径减少了COPD中MMP9、MMP12的表达,减轻肺组织结构破坏。

M_3受体激动剂对慢性心衰大鼠心肌Ⅰ_(Ca-L)及[Ca^(2+)]_i的影响

目的研究M3受体激动剂胆碱(choline)对慢性心力衰竭(CHF)大鼠心肌的保护作用及可能的机制。方法CHF大鼠Ⅱ型胶原酶消化分离单个心肌细胞,全细胞膜片钳技术记录L-型钙电流(ICa-L)变化;激光扫描共聚焦技术观测细胞内钙([Ca2+]i)变化。结果膜片钳实验结果显示,与CHF组比较,choline组ICa-L电流密度明显增高(n=6,P<0.01);预敷U73122后加入choline,与choline组比较,ICa-L电流密度明显下降(n=6,P<0.01)。共聚焦实验结果显示,与CHF组比较,choline组[Ca2+]i明显升高(n=80,P<0.01);与choline组比较,U73122与choline共同孵育组[Ca2+]i升高幅度不明显(n=80,P<0.01)。预先给予4-DAMP可部分逆转choline升高ICa-L及[Ca2+]i的作用。结论M3受体对CHF大鼠的心肌保护作用可能是通过Gq/11-PLC途径开放L-型钙通道,促进Ca2+内流,使[Ca2+]i增加。

促酰化蛋白通过PLC信号途径调控脂滴相关蛋白TIP47的表达

目的研究在3T3-L1脂肪细胞诱导分化过程中促酰化蛋白(ASP)对脂滴相关蛋白TIP47表达的影响,及阻断细胞PLC信号途径后此影响的变化。方法(1)对诱导分化过程中的3T3-L1脂肪细胞分别给予ASP、U73122及U73122和ASP处理,并设立相应空白对照;(2)RT-PCR检测细胞中TIP47mRNA的表达,Westernblot检测细胞中TIP47蛋白的表达。结果(1)ASP对3T3-L1脂肪细胞中TIP47mRNA和蛋白表达有显著的上调作用;(2)PLC信号途径阻断剂U73122对其有显著的下调作用;(3)U73122和ASP处理后脂肪细胞中TIP47mRNA和蛋白表达水平较仅ASP处理的脂肪细胞有显著降低,而较仅U73122处理的脂肪细胞有明显增高。结论PLC信号途径参与ASP调节TIP47表达的信号转导,从分子水平深化了对ASP成脂作用的认识,为肥胖症的认识及防治开拓新的思路。

PLC-γ1信号通路在H_2O_2诱导的PC12细胞凋亡中的作用

目的探讨磷酸脂酶C-γ1(PLC-γ1)信号通路对H2O2诱导的PC12细胞凋亡作用的影响。方法利用PLC-γ1特异性抑制剂U73122(10μmol/L)预处理PC12细胞,阻断50μmol/LH2O2诱导的PLC-γ1信号通路,Hoechst/PI双染观察细胞形态改变,MTT评估细胞活力,流式细胞仪分析凋亡和坏死细胞比例,DNA电泳验证细胞凋亡状态的改变。结果H2O2对PC12细胞活力的影响呈时效和量效关系。PLC-γ1信号通路阻断后,PC12细胞出现了凋亡形态学改变,细胞活力明显降低,流式细胞仪检测出现典型的凋亡亚二倍体峰,凋亡细胞所占比例达35.7%,DNA电泳呈现明显的梯形条带。结论PLC-γ1信号通路在50μmol/LH2O2诱导的PC12细胞凋亡中发挥重要的保护作用。

足细胞损伤的诱导途径:血管紧张素Ⅱ-足细胞瞬时受体电位阳离子通道蛋白6信号通路

背景:瞬时受体电位阳离子通道蛋白6是足细胞上一种新发现的阳离子通道蛋白,是组成裂隙隔膜重要蛋白之一,其表达变化与糖尿病肾病蛋白尿密切相关。目的:观察高糖刺激对足细胞瞬时受体电位阳离子通道蛋白6表达的影响,探讨糖尿病肾病发生发展的可能机制。方法:以永生化小鼠足细胞(MPC5)作为实验对象,将其设为:正常糖组(D-葡萄糖5.6 mmol/L);渗透压对照组(D-葡萄糖5.6 mmol/L+甘露醇25 mmol/L);高糖组(D-葡萄糖30 mmol/L);缬沙坦组(D-葡萄糖30 mmol/L+10-5mol/L缬沙坦);高糖+U73122组(D-葡萄糖30 mmol/L+10μmol/L磷脂酶抑制剂U73122)。各组细胞干预时间为48 h。采用荧光定量PCR和western-blot方法检测各组足细胞瞬时受体电位阳离子通道蛋白6、nephrin、血管紧张素ⅡmR NA和蛋白的表达。结果与结论:与正常糖组相比,高糖组足细胞瞬时受体电位阳离子通道蛋白6、血管紧张素Ⅱ蛋白及mR NA水平明显升高(P<0.01),nephrin m RNA及蛋白水平明显降低(P<0.01);与高糖组相比,缬沙坦组瞬时受体电位阳离子通道蛋白6、血管紧张素Ⅱ的表达显著降低(P<0.05,P<0.01);高糖+U73122组瞬时受体电位阳离子通道蛋白6、血管紧张素Ⅱ表达较高糖组明显下降(P<0.05,P<0.01);渗透压对照组与正常糖组之间各因子差异无显著性意义(P>0.05)。结果说明高糖可能通过血管紧张素Ⅱ-瞬时受体电位阳离子通道蛋白6反馈信号通路损伤足细胞,同时也为血管紧张素受体拮抗剂通过此通路保护足细胞而治疗糖尿病肾病的提供了一新的理论基础。

Effect of U-73122 on calcium channel activity in porcine myometrial cells and pancreatic beta-cell line RINm5F

目的：研究Ｕ７３１２２对细胞内钙离子浓度和电压依赖性钙通道的作用．方法：用Ｆｕｒａ２荧光测定胞浆钙浓度和用穿孔膜片箝记录全细胞钙电流．结果：Ｕ７３１２２呈剂量相关明显地降低ＲＩＮｍ５Ｆ细胞与子宫平滑肌细胞的去极化诱导的钙电流，并抑制ＫＣｌ诱导的与ＢａｙＫ８６４４诱导的胞浆钙浓度的增加．Ｕ７３１２２的这种作用对子宫平滑肌细胞要比ＲＩＮｍ５Ｆ细胞强，而一种非磷脂酶Ｃ抑制剂Ｕ７３１２２类似物Ｕ７３３４３也能降低钙电流５０％．结论：Ｕ７３１２２抑制ＲＩＮｍ５Ｆ细胞与猪子宫平滑肌细胞的电压依赖性钙通道和胞浆钙浓度．

绵羊磷脂酶C-γ1对绵羊卵母细胞体外成熟的影响

卵母细胞成熟率可作为衡量体外培养卵母细胞质量和发育能力的指标。本研究旨在探讨PLC-γ1是否参与了绵羊卵母细胞的体外成熟及其影响。将绵羊卵母细胞在含有不同浓度的U73122(PLC抑制剂))及m^(-3)M3FBS(PLC激活剂)的成熟培养液中进行培养,每个浓度150个细胞,重复试验3次,统计细胞成熟率、卵裂率及桑葚胚率以供筛选出PLC-γ1的最佳抑制及促进浓度。qPCR检测0.5μmol·L^(-1)U73122及0.5μmol·L^(-1)m^(-3)M3FBS处理后48 h的卵母细胞中PLC-γ1、BAK、BAX、CASP 3、CASP 8、P 53、BCL 6基因mRNA水平表达情况,Western blot检测0.5μmol·L^(-1)U73122及0.5μmol·L^(-1)m^(-3)M3FBS处理后48 h的卵母细胞中PLC-γ1、BAK、BAX、CASP3、CASP8、P53、BCL6蛋白的表达情况。每个浓度150个细胞,重复试验3次。在绵羊卵母细胞中,0.5μmol·L^(-1)U73122是促进成熟的最佳浓度,0.5μmol·L^(-1)m^(-3)M3FBS是抑制成熟的最佳浓度。0.5μmol·L^(-1)U73122处理组卵裂率和囊胚率均显著低于对照组。0.5μmol·L^(-1)m^(-3)M3FBS处理组卵裂率和囊胚率均显著高于对照组。通过qPCR检测结果显示,与对照组相比,U73122组中BAK、BAX、CASP 3、CASP 8、P 53基因mRNA表达量显著上升,PLC-γ1、BCL 6基因mRNA表达量显著下降;m^(-3)M3FBS组则与之相反。Western blot结果显示,与对照组相比,U73122组中BAK、BAX、CASP8蛋白表达量显著增多,PLC-γ1、BCL6蛋白表达量显著减少,P53和CASP3蛋白表达量无明显变化。m^(-3)M3FBS组中PLC-γ1、BCL6蛋白表达量显著增多,BAX、CASP3、P53蛋白表达量显著减少,BAK、CASP8蛋白表达量无明显变化。综上所述,本研究表明PLC-γ1在绵羊卵母细胞的体外成熟培养中发挥重要作用,其可调节卵母细胞的成熟以及早期胚胎的发育能力。

阻断磷脂酶C-γ1信号通路对卵巢癌细胞凋亡的影响

目的观察阻断磷脂酶C(PLC)-γ1信号通路对卵巢癌细胞凋亡的影响。方法用化学阻断剂U73122处理卵巢癌细胞,光镜观察细胞形态学改变,MTT法评价细胞生长抑制水平,流式细胞仪分析细胞周期变化及细胞凋亡率。结果磷脂酶C信号通路被阻断后,卵巢癌细胞出现明显的细胞凋亡形态学改变,细胞存活率显著下降,流式细胞仪检测到凋亡细胞,与浓度及时间呈一定关系。结论阻断磷脂酶C-γ1能启动卵巢癌细胞的凋亡。