转铁蛋白结合镱跨膜转运及镱对U-87 MG细胞增殖的影响

目的 :研究转铁蛋白 /转铁蛋白受体转运系统对转铁蛋白结合镱 (Yb2 Tf)跨膜转运进入神经胶质瘤U- 87MG细胞 ,以及转铁蛋白结合镱和非转铁蛋白结合镱对U - 87MG细胞增殖的影响。方法 :细胞培养及ICP -MS镱测定法。结果 :随Yb2 Tf浓度增加 ,细胞镱摄入量增加。当浓度达 2 μmol/L时 ,细胞摄取镱基本达到饱和状态。细胞摄入镱量也随镱 :apoTf摩尔比增大而增加 ,当摩尔比达到 1.5时 ,摄入量达到最高水平。 0 .4 μmol/LYb2 Tf可显著抑制U - 87MG细胞增殖 ,而Yb3 +浓度高达 10 μmol对细胞增殖仅有轻微影响。 结论 :转铁蛋白 /转铁蛋白受体介导的膜转运可能是镱跨越U - 87MG细胞的机制之一。转铁蛋白结合Yb3 +可以有效地抑制U - 87MG细胞的增殖。

Smad7通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控人脑胶质瘤U-87MG细胞的生物学性状

目的探讨敲低Smad7对人脑胶质瘤U-87MG细胞增殖和凋亡的影响及机制。方法将U-87MG细胞分为:干扰组、阴性对照组和空白对照组,其中干扰组通过脂质体转染法转染靶向Smad7的siRNA,阴性对照组转染阴性对照siRNA,空白对照组不做任何处理。转染48 h采用Western blot检测Smad7的表达情况,转染后24,48,72 h进行细胞计数以绘制细胞增殖曲线,转染后48 h进行CCK-8实验以检测细胞增殖活力,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot检测PCNA、CyclinD1、Bcl-2、Bax及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达情况。结果与阴性对照组相比,干扰组脑胶质瘤U-87MG细胞增殖能力均增强(P<0.05),细胞增殖相关蛋白PCNA和CyclinD1的表达均升高(P<0.05);细胞凋亡率降低(P<0.05),Bcl-2与Bax的比值降低(P<0.05);p-PI3K、p-Akt和p-mTOR的表达均升高(P<0.05)。结论敲低Smad7可通过PI3K/Akt/mTOR信号促进脑胶质瘤细胞的增殖并抑制其凋亡,Smad7有望成为脑胶质瘤生物治疗的备选靶点。

表达VASH1基因的人脑胶质瘤U-87MG细胞对化疗药物敏感性的变化

目的探讨表达人血管生成抑制因子1(VASH1)的人脑胶质瘤U-87MG细胞对化疗药物的敏感性变化。方法构建针对VASH1的慢病毒载体p GCL-GFP-VASH1,经测序鉴定后转染293T细胞,筛选出适合浓度的慢病毒转染人脑胶质瘤U-87MG细胞,荧光显微镜下检测转染效率;通过RT-PCR和Western blot分析U-87MG细胞VASH1 m RNA和蛋白表达水平;用CCK-8法检测U-87MG细胞在化疗药物顺铂和替莫唑胺作用下的存活率。流式细胞仪检测U-87MG细胞凋亡。结果成功构建p GCL-GFP-VASH1慢病毒载体,并成功转染U-87MG细胞,转染率达70%以上;RT-PCR和Western blot结果证实转染VASH1慢病毒载体的U-87MG细胞表达VASH1 m RNA和蛋白。在顺铂或替莫唑胺作用下,表达VASH1的U-87MG细胞存活率均较未表达VASH1的U-87MG细胞明显降低(P<0.01),而且U-87MG细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。结论 VASH1慢病毒载体转染U-87MG细胞可使其稳定表达VASH1,并提高人脑胶质瘤U-87MG细胞对化疗药物敏感性、增加细胞凋亡率。

异硫氰酸苄酯诱导脑胶质瘤U-87 MG细胞凋亡及其机制的研究

目的探讨异硫氰酸苄酯(benzyl Isothiocyanate,BITC)对人脑胶质瘤细胞系U-87 MG凋亡的诱导作用及其机制。方法 BITC作用U-87 MG细胞后,应用MTS法检测BITC对肿瘤细胞生长的影响,应用流式细胞术检测BITC对肿瘤细胞凋亡的作用和肿瘤细胞内活性氧(ROS)含量的变化,Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Survivin、caspase-3和caspase-8的变化,RT-PCR检测Bcl-2和Survivin基因的mRNA表达,最后检测信号转导分子JNK和转录因子AP-1转录活性的变化。结果 BITC对脑胶质瘤细胞U-87 MG具有明显的抑制作用,其IC 150值为15.2μmol·L-,流式细胞术检测显示10和20μmol·L-1的BITC作用24 h后凋亡率分别为29.3%和68.6%(P<0.05),2和5μmol·L-1BITC作用肿瘤细胞24h后,ROS产生分别为对照组的3.76倍和6.07倍(P<0.05),促凋亡蛋白caspase-3和caspase-8表达上调,抑制凋亡蛋白Bcl-2和Survivin表达下调,Bcl-2 mRNA表达分别是对照组的32.7%和19.2%(P<0.05),Survivin mRNA表达分别是对照组的41.3%和22.7%(P<0.05),JNK磷酸化水平上调,AP-1转录活性分别是对照组的42.5%和26.7%(P<0.05)。结论 BITC可抑制脑肿瘤细胞U-87 MG的生长,可能与细胞氧化损伤和调节细胞内的凋亡相关转录因子和信号通路有关。

miR-370-3p对胶质母细胞瘤U87-MG细胞株增殖能力的影响

目的探讨微小RNA-370-3p(miR-370-3p)对人脑胶质瘤细胞系U87-MG增殖能力的影响及其机制。方法将常规培养的U87-MG细胞分为空白组、无义序列转染组和模拟物转染组,后两组分别转染miRNA无义序列及miR-370-3p模拟物,qRT-PCR法检测其转染效率,免疫印迹法检测转染细胞叉头框蛋白M1(FoxM1)的表达;采用Ed U法评估细胞的增殖能力,采用平板克隆形成实验检测细胞的增殖能力。结果与空白组和无义序列转染组比较,模拟物转染组细胞miR-370-3p表达显著增加(P<0.05),而FoxM1的蛋白表达显著减少(P<0.05);而且模拟物转染组U87-MG细胞增殖能力及克隆形成率均明显减少(P<0.05)。结论 miR-370-3p能够抑制U87-MG细胞的增殖能力,可能与减少FoxM1的表达有关。

小白菊内酯对U-87 MG细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

目的考察小白菊内酯对于人脑恶性胶质瘤细胞U-87 MG细胞系的增殖、细胞周期及凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法采用CCK-8比色法和克隆形成检测法检测小白菊内酯对U-87 MG的增殖抑制作用;采用碘化丙啶(PI)染色后的流式细胞仪检测小白菊内酯处理前后对细胞周期、凋亡的影响;采用q PCR以及Western blotting法研究药物处理后U-87MG细胞的Caspase 3、Bax、Cyclin D1的表达变化以及P53-Ser392蛋白质磷酸化激活。结果小白菊内酯可明显抑制U-87 MG的细胞增殖、克隆形成数量及克隆大小。处理48 h后,U-87 MG细胞的S期、G2/M期受到了阻滞,G0/G1期细胞比例明显减少,同时细胞的凋亡也明显增多。Caspase 3、Bax基因的m RNA及蛋白表达明显上升,而Cyclin D1基因的m RNA表达明显下降。同时P53-Ser392残基的磷酸化水平也明显上升。结论小白菊内酯可通过调节P53基因的Ser392残基磷酸化抑制其下游的细胞凋亡、细胞周期途径上Caspase 3、Bax、Cyclin D1的基因表达,影响细胞周期及凋亡,从而抑制肿瘤细胞的增殖。

小白菊内酯对U-87MG迁移、侵袭的影响及其机制研究

目的研究小白菊内酯对恶性人脑胶质瘤细胞系U-87 MG细胞迁移、侵袭的抑制作用,并探讨其作用机制。方法采用CCK-8比色检测法筛选小白菊内酯处理细胞的IC50浓度;采用细胞划痕实验观察小白菊内酯处理0、12、48 h后U-87 MG细胞的迁移情况,并且测量48 h后迁移的距离;采用Transwell实验观察穿膜细胞数,判断细胞的侵袭能力;并采用q PCR以及Western blotting法研究了小白菊内酯处理后,U-87 MG细胞的SNAIL、E-Cadherin的表达变化,以及GSK3β-Ser9蛋白质磷酸化变化。结果 CCK-8比色检测法筛选的小白菊内酯IC50浓度为39μmol/L。与对照组比较,在小白菊内酯处理48 h后,U-87 MG细胞迁移的距离和穿膜细胞数都明显减少,且与浓度呈正相关(P<0.01);与对照组比较,小白菊内酯处理的U-87 MG细胞内SNAIL基因表达下降,同时E-Cadherin表达上调,且表达差异明显(P<0.05);GSK3β-Ser9残基磷酸化水平下降。结论小白菊内酯能够抑制U-87 MG细胞的迁移、侵袭,可能是通过下调GSK3β磷酸化从而抑制了SNAIL蛋白表达入核,从而促进了E-Cadherin蛋白的表达而引起的。

神经调节蛋白1,3和4促胶质瘤细胞迁移比较研究

目的研究不同神经调节蛋白亚型NRG1、NRG3和NRG4对不同人胶质瘤细胞迁移的影响。方法U-87 MG、U251及SHG44细胞划痕后,给予浓度0、2、5、10 nmol·L^(-1)重组人源神经调节蛋白。于划痕后0-48 h范围测量细胞迁移率。使用GEPIA数据库分析低级别胶质瘤和胶质母细胞瘤样本中神经调节蛋白及受体表达水平变化。结果rNRG1β、rNRG3β和rNRG4β均可不同程度促进U-87 MG、U251及SHG44细胞迁移。rNRG3β和rNRG4β的促迁移作用弱于rNRG1β。低级别胶质瘤样本中NRG1和NRG4表达水平明显低于正常对照组,ErbB2、ErbB3和ErbB4表达水平高于正常对照组;胶质母细胞瘤样本中NRG1、NRG3和NRG4表达水平显著低于正常对照组,而ErbB2表达水平显著高于正常对照组,ErbB3和ErbB4表达水平低于正常对照组。结论NRG1、NRG3和NRG4均可不同程度促进胶质瘤细胞迁移。3种NRG亚型在胶质瘤浸润和转移中的作用存在差异性,其原因可能系相应ErbB受体表达水平差异。

泛素连接酶LRSAM1对人神经胶质母细胞瘤细胞生物学行为的影响及其可能机制

目的探讨泛素连接酶LRSAM1在CD166降解中的作用及其对人神经胶质母细胞瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法人神经胶质母细胞瘤U-87 MG细胞,采用免疫共沉淀法检测LRSAM1与CD166是否存在结合;将对数生长期U-87 MG细胞分为pcDNA3.1-LRSAM1组、pcDNA3.1-NC组和空白对照组,pcDNA3.1-LRSAM1组和pcDNA3.1-NC组细胞分别转染pcDNA3.1-LRSAM1质粒载体和pcDNA3.1空质粒载体,空白对照组细胞正常培养,采用实时荧光定量PCR法检测3组细胞LRSAM1 mRNA相对表达量,采用Western blot法检测LRSAM1蛋白相对表达量,采用免疫荧光染色法检测LRSAM1与CD166表达情况,采用细胞克隆形成实验检测细胞集落形成数目,采用Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡率,采用细胞划痕试验检测细胞划痕愈合率,采用Transwell小室实验检测侵袭细胞数。结果 U-87 MG细胞中LRSAM1与CD166存在结合。pcDNA3.1-LRSAM1组细胞LRSAM1 mRNA和蛋白相对表达量(3.26±0.28、0.72±0.06)均高于空白对照组(1.00±0.03、0.18±0.01)和pcDNA3.1-NC组(0.99±0.02、0.19±0.02)(P<0.05),转染成功。U-87 MG细胞LRSAM1与CD166共定位,pcDNA3.1-LRSAM1组LRSAM1荧光染色强度增加,CD166荧光染色强度减弱;转染后pcDNA3.1-LRSAM1组细胞集落形成数目[(69.21±7.54)个]、侵袭细胞数[(33.71±4.17)个]均少于空白对照组[(142.38±14.61)、(68.87±9.42)个]和pcDNA3.1-NC组[(152.40±15.92)、(75.54±9.06)个](P<0.05),细胞凋亡率[(17.41±2.03)%]高于空白对照组[(8.07±0.79)%]和pcDNA3.1-NC组[(8.45±0.88)%](P<0.05),细胞划痕愈合率[(30.16±4.10)%]低于空白对照组[(58.22±5.82)%]和pcDNA3.1-NC组[(62.09±7.13)%](P<0.05);空白对照组与pcDNA3.1-NC组各指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论过表达LRSAM1可抑制人神经胶质母细胞瘤U-87 MG细胞增殖、侵袭与迁移,促进细胞凋亡,其机制可能与LRSAM1结合CD166有关。

ChiMR1-DOX抗体偶联药物的制备及其抗肿瘤效应

为了制备得到能够识别EGFRvⅢ的ChiMR1-阿霉素(DOX)抗体偶联药物,并研究其抗肿瘤活性。本研究利用葡聚糖T10为连接子,将其与阿霉素及ChiMR1抗体在室温下进行缩合反应,生成ChiMR1-DOX抗体偶联药物,并通过分别测定DOX小分子和抗体ChiMR1的浓度以确定其偶联比。利用ELISA和MTS法检测ChiMR1-DOX抗体偶联药物对DK-MG细胞(表达EGFRvⅢ)和U-87MG细胞(表达EGFR)的亲和性和杀伤效果,研究ChiMR1-DOX抗体偶联药物的靶向性和抗肿瘤活性。其中Western blotting结果表明ChiMR1-DOX抗体偶联药物在72 kD左右出现一条弥散条带,而ChiMR1抗体和阴性对照无此条带,表明ChiMR1抗体与DOX通过葡聚糖T10偶联成功。ChiMR1-DOX抗体偶联药物中DOX的浓度为0.162 mg/mL,ChiMR1的浓度为0.802 mg/mL,其偶联比约为1∶10。细胞ELISA结果显示ChiMR1-DOX抗体偶联药物能准确识别表达EGFRvⅢ的DK-MG细胞,而不能识别表达EGFR抗体的U-87MG细胞。MTS实验结果表明制备的ChiMR1-DOX抗体偶联药物特异性的抑制DK-MG细胞的增殖,表明制备的抗体偶联药物具有良好的抗肿瘤活性和较强的靶向能力。本研究为进一步的研究和深度开发抗体偶联药物奠定了实验基础。