甘薯U6启动子克隆及其转录活性分析

在CRISPR/Cas9基因编辑系统中,U6启动子可以通过驱动sgRNA的表达来编辑目的基因,因而其转录活性会影响基因编辑效率。尽管人们已经在拟南芥、玉米、大豆、棉花等植物中开展了U6启动子的克隆与应用研究,然而目前在甘薯中U6启动子的相关研究还未见报道。本研究利用拟南芥的AtU6 SnRNA的保守序列在三浅裂野牵牛(Ipomoea trifida)基因组数据库中搜索候选U6 RNA,然后在其上游搜索到2个不同的候选U6启动子,长度分别为526 bp(IbU6p-1)和532 bp(IbU6p-2);序列比对分析结果显示,甘薯的U6启动子具有上游序列元件(USE)以及TATA-box,其序列也与拟南芥高度相似。然后,利用获得的U6启动子核酸序列构建了能够驱动萤火虫荧光素酶基因(LUC)表达的重组框U6::LUC。最后,将含有上述重组载体的根癌农杆菌瞬时转化到本氏烟草叶片和甘薯愈伤组织中,并通过荧光成像技术分析荧光素酶活性。结果发现,在烟草及甘薯愈伤组织中2个甘薯U6启动子均能驱动LUC基因表达,具有转录活性。同时,IbU6p-2的转录活性无论是在烟草叶片中还是在甘薯愈伤组织中都显著高于拟南芥U6启动子。本研究结果为进一步发展甘薯基因编辑技术提供了参考。

U6G超大规模MIMO技术

为了满足不断攀升的数据传输速率需求,扩大频带宽度、增加天线数量是直接有效手段。在6G应用场景与关键能力的驱动下,6 425~7 125 MHz频段(U6G)超大规模多输入多输出(MIMO)技术成为满足6G需求的潜在使能技术之一。基于U6G超大规模MIMO系统的天线形态及信道特征,针对该技术面临的成本、开销、复杂度三重挑战,提出高效能U6G超大规模MIMO无线传输的总体设计目标,并展望其未来研究趋势。

月季‘月月粉’与野蔷薇U6启动子的克隆及活性分析

【背景】U6启动子是CRISPR/Cas9基因编辑系统中驱动sgRNA转录的重要元件,而不同物种的U6启动子转录活性可能存在差异,且物种内源U6启动子相比物种外源U6启动子可能具有更高效的启动效率。迄今对蔷薇属(Rosa)植物的U6启动子少有报道,且尚未获得转录活性强于拟南芥U6的启动子。【目的】筛选转录活性更高的蔷薇属植物U6启动子,为后续月季和野蔷薇等蔷薇属植物CRISPR/Cas9基因编辑系统的优化和分子育种奠定基础。【方法】利用拟南芥保守的102 bp U6 snRNA序列,从中国古老月季‘月月粉’(Rosa chinensis Old Blush,OB)基因组中克隆相似性最高的6个OBU6启动子,从野蔷薇(R.multiflora)基因组中克隆相似性最高的7个RmU6启动子,并构建OBU6启动子和RmU6启动子分别驱动LUC和GUS报告基因的融合表达载体,利用农杆菌介导的瞬时转化法转染本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片和月季‘萨曼莎’(R.Samantha)组培苗,通过双荧光素酶活性检测和GUS组织化学染色对月季和野蔷薇的启动子转录活性分别进行比较。【结果】‘月月粉’6个OBU6启动子和野蔷薇7个RmU6启动子均具有影响U6启动子转录活性的两个必要元件USE和TATA box。双荧光素酶活性检测和GUS组织化学染色结果显示,月季‘月月粉’OBU6启动子和野蔷薇RmU6启动子均具有转录活性,但OBU6启动子的转录活性均弱于拟南芥AtU6-1启动子。考虑到过长的U6启动子可能会削弱其转录活性,于是选取其中转录活性相对较高的OBU6-4进行5′端截短(1507、1076、574和187 bp),但截短后的启动子未能提高转录活性;而在野蔷薇中,成功筛选到一个长度为630 bp的RmU6-2启动子,其转录活性显著高于拟南芥AtU6-1启动子。【结论】从月季‘月月粉’中克隆得到6条U6启动子,从野蔷薇中克隆得到7条U6启动子,并筛选出一条转录活性显著高于拟南芥AtU6-1启动子的野蔷薇U6启动子RmU6-2,为构建蔷薇属植物CRISPR/Cas9基因组编辑系统提供了极具应用潜力的启动子。

家庭教育视阈下体育活动对U6-11儿童隐性教育作用的分析

通过文献资料法、访谈法、问卷调查法、数理统计等方法,对隐性教育进行定义,从家庭教育的视野出发,以体育为载体,研究在家庭教育背景下体育活动对U6-11儿童的身心发展和体育价值形成等方面的影响,从而培养U6-11儿童在体育活动过程中建立和发展起来的各种符合其身心发展的综合能力,以期促进儿童增强体质,增进健康;转变家长传统教育观念;顺应时代潮流;发挥体育价值等作用。

桉树LH_(22)、U_6无性系茎提取液对绿豆插条发根和种子萌发的影响

研究表明,难生根的尾叶桉×赤桉LH_(22)无性系茎的粗提液对绿豆插条发根率、不定根长度有极明显的抑制作用,而易生根的尾叶桉U_6无性系茎的粗提液却没有抑制作用。对这些茎粗提液进一步用有机溶剂萃取分离,各萃取相进行白菜种子萌发的生物测验,表明LH_(22)中的水相、乙醚相含有抑制种子萌发的物质,经Duncan's新复极差法分析抑制作用显著,而易生根的U_6中却无影响。水相、乙醚相分别再经硅胶柱层析技术分离纯化得到多种不同的成分,进行白菜种子萌发生物测验后,有数种成分有明显的抑制作用。因此说明,难生根的LH_(22)无性系茎内含有成分不同的生根抑制物质,而易生根的U_6无性系茎内几乎没有或含有少量这些生根抑制物质。

禽U6启动子的克隆、序列分析及其驱动的siRNA表达

【目的】分离用于禽源细胞中表达短干扰RNA(short interference RNA,siRNA)的禽U6启动子。【方法】以鸡基因组为模板进行PCR扩增,将扩增产物进行序列测定和生物信息学分析,并将其插入报告基因载体pEGFP-N1中,获得siRNA表达载体pGFP-U6,将由软件预测针对GFP基因的siRNA所对应的shRNA(short hairpin RNA)插入其中,获得pGFP-U6-shRNA;以含人H1启动子的siRNA表达载体pGFP-H1-shRNA为对照,分别转染COS-1和DF-1细胞,用荧光显微镜和流式细胞仪测定转染细胞培养中GFP阳性细胞数和荧光总量。【结果】克隆的U6启动子位于鸡28号染色体,与发表的鸡U6-3启动子同源性为97.2%,含多个Oct-1序列,不含CACCC框、SPH和PSE等聚合酶Ⅲ启动子序列,TA框不典型;在pGFP-U6-shRNA转染的哺乳动物源COS-1细胞培养中,GFP阳性细胞数和荧光总量均有所下降,但不如pGFP-H1-shRNA转染细胞显著;在pGFP-U6-shRNA转染的禽源DF-1细胞培养中,不仅GFP阳性细胞数和荧光总量显著下降,而且基因沉默效果显著优于pGFP-H1-shRNA转染细胞。【结论】成功克隆的禽U6启动子不仅能有效转录siRNA,而且转录活性具有相对的细胞种属特异性。

尾叶桉U6遗传转化再生体系的建立

以桉树品种尾叶桉U6叶盘为外植体,选用MS培养基为基本培养基,附加激素6-BA,IAA,IBA,NAA,通过研究不同激素浓度组合对外植体愈伤诱导及不定芽分化的影响,建立了较好的遗传转化再生体系。结果表明,尾叶桉U6叶盘最适分化培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+2,4-D 1 mg/L+IAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉5 g/L;小苗的最佳生根培养基为MS+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉5 g/L。40 mg/L卡那霉素可以抑制叶盘的分化;20 mg/L卡那霉素可以抑制再生植株的生根。2种抑菌抗生素中,头孢霉素对叶片再生影响较大;而250 mg/L的羧苄青霉素能有效地抑制农杆菌菌株EHA105的生长,却对尾叶桉叶盘的芽分化影响不大,为适宜的抑菌抗生素。3种农杆菌LBA4404,EHA105,GV3101的菌液浸染桉树叶盘,统计其愈伤组织GUS染色率,以EHA105对外植体的浸染能力最强,达83.3%。

尾叶桉U6无性系萌芽性能研究

尾叶桉U6是南方分布最广的桉树无性系之一。研究表明,3个月生的U6的萌芽点、萌芽条数和萌芽高度均服从W eibull分布,峰度均大于3,比正态分布的峰值高;偏度大于0,呈不对称分布,数据均值右侧的离散性比左侧的强。萌芽点数按伐桩高度和伐桩直径分布均呈随机性,表明萌芽点数与伐桩高度和伐桩直径无关,仅与其生物学特性有关。萌芽条数受伐桩直径和高度的影响,伐桩直径越大,萌芽条数越多,呈线性关系;当伐桩高度低于16 cm时,萌芽条数随伐桩高度的增加而增加,超过16 cm高度后随之减少,呈三次抛物型。萌芽条高度与伐桩高度有关,当伐桩高度低于12 cm时,萌芽高度随伐桩高度的增加而增加,到12 cm以后随之减少;萌芽条高度与伐桩直径呈负相关。

利用人U6 snRNA启动子构建RNA干扰质粒载体

RNA干扰技术已经成为基因功能研究等领域的有力工具,构建带有筛选标记的siRNA载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达.为了利用RNAi技术开展生物学研究,在克隆载体pUC19的基础上改造构建了人类细胞小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)表达质粒pUC19NU.该质粒具有新霉素抗性标记和真核细胞复制起点,利用连入的人U6snRNA启动子起始siRNA的转录.以EGFP和p53为靶基因的干扰实验证明,所构建的siRNA表达质粒可以显著抑制细胞外源性增强绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescent protein,EGFP)及细胞内源性p53蛋白的表达,而且抑制效果具有特异性.

基于综合指数法和布拉德福定律的重要研究机构测定——以水路运输(U6)为例

针对交叉学科领域图书馆采访人员依靠出版社进行中文图书采购费时费力的问题,以水路运输（U6）为例,利用中国知网学术期刊网络出版总库提取该领域2004~2013年的研究机构所发核心论文篇数、被引量和下载量;依据核心论文是否被SCI、EI、CSSCI检索数据库收录,分别设置不同的论文篇数权值,然后依据论文作者所在研究机构的排名,提出了某一篇论文的篇数当量计算方法,从而计算某一研究机构所发论文篇数当量;最后根据某一机构所发论文的篇数当量,采用综合指数法和布拉德福定律对重要研究机构进行了测定和分区。

家蚕细胞色素P450基因Bmcyp6u1的克隆、序列分析与表达谱

细胞色素P450第6亚家族基因为昆虫所特有,与抗性相关。为了检测家蚕Bombyx mori cyp6u1基因是否与耐氟性相关,首先克隆了cyp6u1基因。采用生物信息学方法获得与黑腹果蝇Drosophila melanogaster cyp6u1基因同源的家蚕B.moricyp6u1基因序列,预测该序列的开放阅读框(ORF)为1476bp,编码491个氨基酸,推定的蛋白质分子质量为56.15kD,等电点为9.23。以家蚕5龄第3天幼虫精巢cDNA为模板,设计特异引物PCR扩增出一条约1500bp的条带,大小与家蚕cyp6u1序列的ORF预测值接近,命名为Bmcyp6u1基因(GenBank登录号:HM130560)。同源性分析表明,Bmcyp6u1基因与蜜蜂Apis mellifera的同源基因cyp6AS13的相似性为56%,与拟南芥Arabidopsis thaliana的cyp72A82的相似性为48%,与人Homosapiens的cyp3A7基因的相似性为50%。芯片数据分析表明,Bmcyp6u1基因在家蚕5龄第3天幼虫各组织表达量很低,只在精巢组织(5龄第3天)稍有表达,推测该基因具有组织特异性。

利用Ⅱ型启动子转录的U6 RNA提高植物病毒表达载体在植物中表达外源基因的水平

Ⅱ型启动子转录的外源短链RNA可以竞争性抑制细胞内源mRNA的核质转运,因而可能会提高植物RNA病毒载体表达的外源基因在植物中的积累.为了验证这一假说,利用OE-PCR技术合成拟南芥U6-1核内小RNA序列,并构建其Ⅱ型启动子转录的植物表达载体.以农杆菌渗滤技术,与烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)表达载体共接种寄主植物本氏烟,通过对报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的荧光观察,并以Western印迹和ELISA测定GFP在烟草中的表达情况,分析共表达Ⅱ型启动子转录的U6 RNA对外源基因在植物中表达的作用效果.结果表明,共接种Ⅱ型启动子转录的U6 RNA对TMV病毒表达载体表达外源基因的水平有明显的增效作用,推测RNA核质转运干扰是提高外源基因表达的可能机制.

双效表达载体的构建及其U6启动子的功能效率鉴定

利用pBudcE4.1双表达载体构建shRNA与蛋白共表达载体,为双效疫苗的研制提供新的研究思路。以含U6启动子的载体为模板,PCR扩增得到U6启动子,用其置换载体pBudcE4.1内的CMV启动子的核心部分构建shRNA与蛋白共表达载体。用干扰绿色荧光蛋白表达的方法鉴定重组载体中的U6启动子能否启动shRNA的表达。经PCR扩增、双酶切鉴定及DNA测序证明成功构建了载体pBudcE4.1-U6。用干扰载体pBudcE4.1-U6-eGFPshRNA与含eGFP的载体共转染293T细胞后,荧光显微镜观察显示eGFP的表达量下降;流式细胞仪检测细胞的转染效率降低。研究结果证明U6启动子正常发挥作用。成功构建RNAi与蛋白共表达载体,为利用该载体研制动物双效疫苗奠定了基础。

含红色荧光蛋白DsRed2的RNA干扰载体pDsRed2-SilencerU6构建

目的构建含红色荧光蛋白DsRed2的RNA干扰质粒载体pDsRed2-SilencerU6,便于利用荧光显微镜、FACS等实验技术开展RNA干扰研究。方法质粒pDsRed2-N1中DsRed2蛋白的编码基因BbsⅠ酶切位点无意突变后,破坏pDsRed2-N1多克隆位点,PCR扩增CMV启动子、DsRed2蛋白基因片段并将其克隆至RNA干扰载体pSilencerU6,得到pDsRed2-SilencerU6质粒,利用脂质体转染技术将其转染HEK293T细胞,荧光显微镜、FACS检测转染效率。结果DsRed2蛋白编码基因序列BbsⅠ点突变正确,成功构建pDsRed2-SilencerU6载体,其在HEK293T细胞中可显著表达红色荧光蛋白,利用脂质体转染技术,转染效率达70.61%。结论成功构建含红色荧光蛋白DsRed2的RNA干扰载体pDsRed2-SilencerU6并在哺乳动物细胞中表达,为今后开展RNA干扰研究提供了基础。

人U6基因POI Ⅲ启动子表达反义VEGF cDNA抑制SMMC-7721肝癌细胞VEGF表达的观察

由 RNA聚合酶启动子在细胞内转录高浓度反义 RNA是抑制靶蛋白的一种有效手段 ,有报道 POI 启动子转录小分子 RNA存在效率不高 ,带有较多的非特异性序列等缺点 ,为了克服这些问题 ,表达反义 VEGF RNA的人 U6基因表达盒对人肝癌细胞株 SMMC- 772 1 VEGF表达的抑制作用进行了研究 .首先 PCR扩增 2 0 0 bp VEGF c DNA以正、反向插入人 U6 sn RNA.通过测序证实反向插入的正确性 .采用细胞原位杂交 ,RNA酶保护分析 ,Northern印迹来证实反义 RNA表达的情况 ,利用 RT- PCR方法研究了其对人肝癌细胞株 SMMC- 772 1 VEGF表达的抑制效果 .细胞原位杂交结果显示 U6启动子转录产物主要分布于细胞核内 ,细胞浆内亦有表达 ,RNA酶保护分析显示 U6基因 POI 启动子能高表达所需大小反义 RNA,Northern印迹结果显示脂质体 lipo-fectamine介导含 U6基因 POI 启动子的质粒转染人肝癌细胞株 SMMC- 772 1后 1 2 h即有表达且可持续表达 6 d. RT- PCR证实 U6基因 POI 启动子转录的反义 VEGF RNA能有效抑制SMMC- 772 1细胞 VEGF的 m RNA表达 .已有的研究结果揭示 POI

狗尾草U6启动子的克隆及功能鉴定

狗尾草是重要的模式植物,是研究C4光合作用的优秀模型,具有热带植物的典型特征。U6启动子主要用于构建RNAi和CRISPR表达载体,有启动干扰发夹结构的表达和基因编辑引导序列复合结构的表达的作用,该启动子具有特殊的启动位点G,能够保证转录后RNA结构的完整性。随着CRISPR技术的发展,利用狗尾草进行基因编辑的研究日益增多和深入,目前还没有针对狗尾草U6启动子的克隆及功能鉴定。U6启动子具有种属特异性,在转基因技术中,使用转化物种本身或亲缘物种的U6启动子能取得更高的的启动效率,本研究克隆了狗尾草2个U6启动子基因,并构建不同序列长度的U6启动子序列驱动GUS基因的表达,GUS融合表达载体转化狗尾草胚性愈伤,瞬时表达验证表明,克隆出的2个狗尾草U6启动子在狗尾草上具有很强的启动效率;并且将该载体转化狗尾草后,获得了能够稳定表达GUS基因的转基因植株;将该U6启动子用于构建狗尾草PDS基因CRISPR编辑载体,获得能够稳定表达的白化苗,说明克隆的狗尾草U6启动子能够很好的启动基因编辑载体的转录。

pEGFP-C1/U6质粒载体介导的表达MDR1shRNA的质粒构建

为了构建pEGFP-C1/U6载体介导MDR1短发卡RNA(shorthairpinRNA,shRNA)表达的质粒,针对MDR1的19碱基大小的片段,分别设计2对寡核苷酸,形成双链后将其依次连入带有U6启动子的pEGFP-C1载体(命名为pEGFP-C1/U6),两对DNA双链连接后形成中间由9个碱基序列间隔的反向互补序列,构建成能产生MDR1短发卡RNA的质粒。结果表明:经酶切、连接后构建成的质粒(pEGFP-C1/U6/A和pEGFP-C1/U6/B),经酶切与测序证实构建成功,无任何碱基突变。结论:成功构建了能表达MDR1shRNA的质粒载体pEGFP-C1/U6/A和pEGFP-C1/U6/B,此项研究结果可能为临床上逆转肿瘤多药耐药提供一种有效的方法。

构建并检测以人U6 snRNA为启动子的RNA干扰质粒载体

目的:应用人U6启动子构建RNA干扰载体pUC19NU,具有新霉素抗性且能够在真核细胞中复制,成为基因功能和基因治疗研究等领域的RNA i技术的工具。方法:通过PCR从人类基因组中得到人U6 snRNA启动子,并针对增强绿色荧光蛋白(EGFP)和p53蛋白的基因,分别设计了两段可以转录出短发夹环状RNA的DNA模板序列,连入pUC19中,构建出RNA干扰质粒pUC19NU,分别得到质粒载体pUC19NUE和pUC19NUP。结果:以EGFP和p53为靶基因的干扰实验证明,两种质粒载体分别转染HeLa细胞和KMB-17细胞,两种蛋白的表达皆受到有效抑制。结论:该质粒能够有效地干扰相应内源性和外源性靶基因的表达,可以用于RNA i技术的研究。

尾叶桉U6无性系林分密度效应研究

文章分析了造林密度对 6年生尾叶桉U6无性系林分各生长因子的影响 ,结果表明 :造林密度对桉树人工林各林分生长因子的影响显著性不同 ,密度与胸径、单株材积生长呈显著负相关关系 ,6年生U 6无性系人工林平均胸径及平均单株材积生长量以密度D (16 6 5株 /hm2 ) >C(2 2 5 0株 /hm2 ) >B(2 812株 /hm2 ) >A(3333株 /hm2 )。密度对树高、林分蓄积量的生长均有一定影响 ,但差异不显著 ,林分平均树高生长量随着密度的增加而递减 ,林分蓄积量则以C处理最大 ,达 15 3.92 14m3/hm2 ;适宜造林密度范围在 15 36～ 2 4 81株 /hm2 之间。