稳定低表达BAG3的胶质母细胞瘤U87细胞株的构建及鉴定

目的探讨构建稳定低表达BAG3的胶质母细胞瘤U87细胞株的方法。方法利用RNA干扰技术提取pEGFP-BAG3-sh RNA质粒后采用ABI3130基因测序仪进行测序鉴定,将鉴定后的质粒分别转染到胶质母细胞瘤U87细胞株,利用嘌呤霉素筛选转染的U87细胞,通过RT-PCR、免疫印迹分析和免疫荧光染色等技术对转染后的U87细胞进行鉴定。结果 pEGFP-BAG3-shRNA质粒测序结果包含干扰序列,筛选后的干扰组和对照组U87细胞转染效率分别为85%和93%,RT-PCR结果显示sh BAG3质粒干扰组BAG3 mRNA表达量显著低于对照组(P<0.05);免疫印迹分析及免疫荧光染色结果显示shBAG3质粒干扰组BAG3蛋白表达量显著低于对照组(P<0.05)。结论本研究所构建的胶质母细胞瘤U87细胞株能稳定低表达BAG3,可用于后续BAG3在胶质母细胞瘤中的生物学作用及相关信号通路的研究。

Rho激酶抑制剂Y-27632对人U87胶质瘤细胞侵袭能力的影响

目的观察Rho激酶(ROCKS)特异性抑制剂Y-27632对体外培养的U87胶质瘤细胞侵润能力的影响。方法体外培养U87胶质瘤细胞,采用Transwell体外细胞侵润实验,用浓度分别为0、10、25、50μmol/L的Y-27632处理U87细胞,检测下室中洗脱液的吸光度值(OD值)比较不同浓度的Rho激酶抑制剂Y-27632对人U87胶质瘤细胞侵袭能力的影响。实验结果用SPSS 17.0进行方差分析。结果 Transwell小室培养的U87胶质瘤细胞洗脱液的OD值分别为(0.28±0.052)、(0.22±0.046)、(0.17±0.023)、(0.12±0.034)。其中当Y-27632浓度为25μmol/L时其OD值与对照组统计学处理差异有统计学意义(P<0.05);50μmol/L时其OD值与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);25μmol/L组与50μmol/L组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论适当浓度下Rho激酶抑制剂Y-27632能明显抑制U87胶质瘤细胞的体外侵润能力。

绞股蓝总皂苷对胶质母细胞瘤细胞株U87细胞形态、迁移能力的影响

目的观察不同剂量绞股蓝总皂苷(Gyp)对胶质母细胞瘤(GBM)细胞株U87细胞形态、迁移能力的影响,并探讨其机制。方法取对数生长期U87细胞,分别加入10、5 mg/mL的Gyp溶液100μL及等量PBS(分别计为A、B、C组),常规培养细胞。比较各组细胞形态、迁移能力及IL-6蛋白。结果 A组细胞生长慢、体积小、固缩现象非常明显,细胞贴壁现象接近消失;B组细胞生长缓慢,体积缩小,胞质固缩,部分细胞甚至破裂死亡,细胞贴壁现象减弱;C组细胞生长规则,轮廓清晰,形态饱满,胞体透亮,贴壁生长良好。A、B、C组细胞迁移覆盖区域占原有划痕区的54.8%、82.4%、98.6%,两两比较,P均<0.05。A、B、C组穿膜细胞个数分别占19.8%、58.9%、100%,两两比较,P均<0.05。A、B、C组IL-6蛋白水平分别为小量、中等量、多量,两两比较,P均<0.05。结论Gyp可抑制U87细胞生长及减弱细胞迁移能力,尤以10 mg/mL的Gyp效果更佳,机制可能与其可抑制IL-6蛋白表达有关。

山楂叶总黄酮对胶质瘤U87细胞的抑制作用

目的研究山楂叶总黄酮对胶质瘤U87细胞的抑制作用。方法体外培养U87细胞,采用25、50、100mg·L^-1的山楂叶总黄酮,通过CCK-8实验、划痕实验、Transwell法、黏附实验,检测山楂叶总黄酮对U87细胞增殖、迁移能力、侵袭能力、黏附能力的影响;克隆形成实验检测细胞克隆形成能力。结果与空白对照组相比,山楂叶总黄酮呈浓度依赖性抑制U87细胞的增殖、迁移、侵袭及黏附能力,差异具有统计学意义(P<0.05),山楂叶总黄酮50mg·L^-1时抑制胶质瘤U87细胞生长作用最为明显。结论山楂叶总黄酮对胶质瘤U87细胞有一定的抑制作用。

恶性胶质瘤U87细胞中miR-147启动子区甲基化程度对miR-147表达及细胞增殖的影响

目的探究恶性胶质瘤U87细胞中微小RNA-147(miR-147)启动子区甲基化程度与miR-147表达量及细胞增殖的关系。方法使用0μmol/L(空白组)、4μmol/L以及16μmol/L的5′aza-dC培养基培养U87细胞,通过亚硫酸氢盐修饰后测序法(BSP法)检测每组细胞中miR-147启动子区甲基化情况;使用QPCR法检测各组miR-147表达量,并对细胞进行计数,计算U87细胞受抑制程度。结果空白组甲基化率为14.6%,miR-147相对表达量为0.29±0.02;4μmol/L组甲基化率为8.9%,miR-147相对表达量为0.66±0.03,有19.4%的细胞受抑制;16μmol/L组甲基化率为3.4%,miR-147相对表达量为1.09±0.05,有51.6%的细胞受抑制。各组miR-147相对表达量比较,差异具有统计学意义(P<0.001)。结论U87细胞中miR-147启动子区的甲基化程度改变可能是影响U87细胞中miR-147表达的因素之一,并且甲基化程度越低,U87细胞增殖受抑制越明显。

FHL2通过MGMT影响胶质母细胞瘤U87细胞对替莫唑胺的耐药性

目的:探讨干扰四个半LIM结构域蛋白2(FHL2)的表达对胶质母细胞瘤U87细胞中O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)表达的影响,以及对U87细胞替莫唑胺(TMZ)耐药性的影响。方法:利用慢病毒感染技术分别将携带不同FHL2干扰序列的慢病毒(shFHL2-1#、shFHL2-4#)及其阴性对照(shN)感染U87细胞,分别命名为shFHL2-1#、shFHL2-4#和shN组;采用siRNA转染技术将siMGMT-1#、siMGMT-4#和siN转染至U87细胞,为siMGMT-1#、siMGMT-4#和siN组,qPCR和WB法验证FHL2或MGMT的敲低效果。用TMZ处理上述各组细胞(以DMSO处理组为对照),随后以CCK-8法和细胞克隆形成实验检测TMZ处理前后FHL2或MGMT敲低组细胞的增殖情况,FCM检测TMZ处理前后FHL2敲低组细胞的凋亡情况,WB法和免疫荧光法检测敲低FHL2对U87细胞中MGMT表达的影响,WB法检测TMZ处理对各组细胞中FHL2和MGMT表达水平的影响。结果:成功构建敲低FHL2或MGMT表达的U87细胞。与shN组相比,shFHL2-1#、shFHL2-4#组U87细胞的增殖能力减弱、凋亡水平升高(均P<0.01),MGMT表达水平明显降低(均P<0.01)。经TMZ处理后,与相应的DMSO处理组相比,shN组细胞中FHL2和MGMT的表达水平显著升高(均P<0.05),而细胞的增殖和凋亡均无显著变化(均P>0.05);shFHL2-1#、shFHL2-4#组细胞中FHL2和MGMT的表达水平无显著改变(均P>0.05),但细胞增殖能力进一步显著降低、凋亡水平进一步显著升高(均P<0.01)。敲低MGMT使U87细胞增殖减慢(P<0.01),而siMGMT-1#、siMGMT-4#组细胞经TMZ处理后增殖能力进一步降低(均P<0.01)。结论:干扰FHL2表达使得U87细胞增殖减慢而凋亡加剧、MGMT表达下调,提示FHL2可能通过影响MGMT的表达调控U87细胞对TMZ的耐药性。

人脑胶质母细胞瘤细胞系U87的单克隆细胞构建及异质性研究

目的人胶质母细胞瘤细胞细胞系U87被作为胶质母细胞瘤(GBM)异质性研究的模型,但从基因水平探讨其异质性来源的研究较少。文章旨在构建人胶质母细胞瘤细胞系U87单克隆细胞株,检测不同单克隆细胞株的表型和遗传背景差异,并探讨产生表型差异的分子机制。方法利用小分子荧光染料羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)作为筛选标记,有限稀释法构建U87单克隆细胞株,并挑选具有典型形态特征的2株单克隆化细胞,经短串联重复序列(STR)鉴定后进行后续研究。采用CCK-8、EdU掺入法增殖实验和和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力;肿瘤干细胞成球实验检测细胞成球能力;免疫荧光和CCK-8法黏附实验检测细胞黏附能力;3D侵袭实验检测细胞侵袭能力;Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞对化疗药物的敏感性;转录组测序(RNA-seq)对细胞进行测序及生物信息学分析;qRT-PCR验证富集通路中代表性差异基因mRNA表达量。结果构建了形态较为均一U87单克隆细胞株CF5和G11。其中CF5小而短粗,G11大而细长。CCK-8增殖实验结果显示,CF5细胞增殖能力较U87、G11明显增强,U87较G11明显增强(P<0.001)。EdU掺入法增殖实验结果显示,CF5 EdU阳性细胞比例(0.54±0.05)较G11细胞(0.35±0.03)、U87(0.44±0.03)明显增加,U87较G11明显增强(P<0.01)。肿瘤干细胞成球实验显示,CF5干细胞成球能力较U87、G11明显增强,U87较G11明显增强(P<0.01)。免疫荧光法黏附实验显示,黏附1 h后G11黏附面积较U87、CF5明显增强,U87较CF5明显增强(P<0.001)。3D培养侵袭实验结果显示,G11细胞侵袭能力较U87、CF5明显增强,U87较CF5明显增强(P<0.05)。交互分析发现CF5相对G11和U87均下调的基因159个,均上调的基因303个;G11相对CF5和U87均下调的基因有281个,上调的基因则有116个;通路富集分析显示CF5和G11在细胞外基质相关的通路有最高的富集度,细胞外基质相关通路与肿瘤侵袭、耐药等功能表型密切相关。结论成功构建从形态、功能表型到基因背景具有显著差异的U87单克隆细胞株CF5、G11,为研究GBM异质性和基因功能奠定了基础。

BMP受体在胶质母细胞瘤起始细胞早期分化中的表达

目的在分离鉴定胶质母细胞瘤U87细胞中的胶质瘤起始细胞(GTICs)的基础上,检测在GTICs细胞中骨形态发生蛋白(BMP)受体1A、B的表达,探讨BMP受体1A、B对GTICs所起的生物学作用。方法利用流式细胞术检测U87细胞中CD133和巢蛋白阳性细胞,细胞免疫荧光和蛋白印迹法检测GTICs和普通细胞中BMP受体1A、B的表达。结果 CD133和巢蛋白阳性表达的细胞在瘤U87细胞中所占的比例分别0.92%和5.72%;GTICs可诱导分化为表达β-微导管蛋白和胶质纤维酸性蛋白的细胞;U87细胞的GTICs中BMP受体1A表达明显增高,而经诱导分化培养后的BMP受体1A的表达又明显降低,BMP受体1B表达变化不明显。结论 BMPs信号通路中BMP受体对调控GTICs的增殖分化可能起着重要作用。

Rho激酶抑制剂Y-27632对胶质瘤细胞生长与迁移能力的影响

目的观察Rho激酶(ROCKS)特异性抑制剂Y-27632对体外培养的U87胶质瘤细胞迁移能力的影响。方法体外培养U87胶质瘤细胞,采用MTT实验、Transwell体外细胞迁移实验,检测Rho激酶抑制剂Y-27632对人U87胶质瘤细胞生长和迁移能力的影响。Rho激酶检测试剂盒检测Y-27632对ROCKS活性的抑制率。结果 Y-27632对U87细胞生长活性无明显影响;细胞迁移能力明显下降,与对照组相比差异性显著,统计学处理P<0.05。随着Y-27632浓度的增加,细胞中ROCKS活性逐渐抑制,呈浓度依赖性。结论 Rho激酶抑制剂Y-27632能明显抑制U87胶质瘤细胞的体外迁移能力。

TCDD对胶质母细胞瘤中环氧合酶2基因表达的影响和生物学作用

胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)是最常见的恶性脑肿瘤,其复发率和死亡率居高不下。环氧合酶2(cyclooxygenase 2,COX2)在正常生理条件下几乎不表达,但持续高表达的COX2常见于各种恶性肿瘤和癌前状态,并参与诸多肿瘤发生发展过程,如血管生成、免疫抑制、迁移侵袭以及化疗抵抗等。二噁英类污染物作为一级致癌物,但目前有关二噁英对GBM发展的研究十分有限。本研究旨在探究二噁英暴露影响GBM发展的分子机制。以COX2为标志物,明确二噁英类污染物中毒性最强的2,3,7,8-二苯并-p-二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)对胶质母细胞瘤U87细胞中COX2基因表达的影响以及芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)在之中的作用,并借助转录组测序进一步探究TCDD暴露后U87细胞中COX2参与的生物过程。实验结果显示,TCDD以AhR依赖的方式上调U87细胞中COX2基因表达并具有时间-剂量依赖效应。转录组分析结果表明,TCDD暴露显著改变了U87细胞中细胞黏附、胞外刺激检测以及膜转运等相关通路的基因表达,COX2可能通过影响脂质形成和维持炎症反应参与U87的改变。进一步的互作分析发现COX2基因与IL1B和CYP2E1相关。本研究补充了TCDD在U87细胞中上调COX2表达的可能机制和影响,并为今后对二噁英促癌作用的研究提供参考。

胶质瘤细胞中β-TrCP和Bmi-1之间可能的调节关系

目的分析胶质瘤细胞β-转导重复相容蛋白(β-TrCP)和B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒插入位点1蛋白(Bmi-1)之间可能的调节关系。方法收集胶质瘤临床样本,对样品进行级别统计及β-TRCP1和Bmi-1基因检测。采用胶质细胞瘤U87细胞进行细胞验证实验,分别转染β-TrCP过表达腺病毒(ad-β-TrCP1组)及靶向β-TrCP mRNA的siRNA(si-β-TrCP1组)。使用蛋白免疫印迹(Western blot)法分别检测各组细胞中β-TRCP1和Bmi-1的蛋白表达水平。结果与非肿瘤组织相比,不同级别的脑胶质瘤临床样本中β-TrCP基因表达水平显著降低,Bmi-1则呈现高表达趋势(P<0.05)。其中,WHO3~4级脑胶质瘤样本中β-TrCP的表达水平显著低于WHO1~2级脑胶质瘤,而Bmi-1的基因表达水平则显著高于WHO1~2级肿瘤组织样本。在细胞实验中,胶质细胞瘤U87细胞中过表达β-TrCP1后Bmi-1蛋白表达显著降低,敲低β-TrCP1基因表达后Bmi-1的蛋白表达水平则显著提高。结论在临床脑胶质细胞瘤组织样品中β-TrCP基因表达显著低于正常组织,而Bmi-1基因则具有高表达特性,β-TrCP1和Bmi-1可能存在上下游调控关系,共同参与并影响神经胶质母细胞瘤的发生发展。

过表达迁移侵袭抑制蛋白基因对人巨细胞病毒转染U87细胞特性影响

目的探讨过表达迁移侵袭抑制蛋白(MIIP)基因对人巨细胞病毒(HCMV)感染的神经胶质母细胞瘤U87细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响。方法采用过表达的MIIP基因慢病毒转染HCMV感染的U87细胞,通过Western-blot检测其转染效率,并将细胞分为为实验组(U87+HCMV/MIIP)、对照组(U87+HCMV/CMV4)和空白组(U87+HCMV)。采用CCK-8检测过表达的MIIP基因对HCMV转染的U87细胞增殖情况的作用;采用Transwell迁移实验检测对细胞迁移情况的影响;采用Transwell体外侵袭实验检测对细胞侵袭能力的影响。结果实验组细胞的MIIP蛋白表达量与对照组和空白组比较,明显上调(P<0.05);细胞的增殖能力与对照组和空白组比较,明显降低(P<0.05);细胞的侵袭力与对照组和空白组比较,明显减弱,且细胞数显著下调(P<0.05);迁移能力与对照组和空白组比较,显著降低(P<0.05)。结论 HCMV感染的U87细胞在MIIP基因过表达后增殖、侵袭及迁移能力均受抑制。

齐墩果酸通过MAPK／ERK信号传导通路对U87MG细胞增殖及凋亡的体外实验研究

目的探讨齐墩果酸（OA）对神经胶质母细胞瘤U87MG细胞增殖及细胞凋亡的影响。方法以U87MG细胞为研究对象，使用25、50、80、100、150和200μg／ml的OA处理24、48和72h后，采用MTF实验检测OA对体外培养U87MG细胞增殖抑制作用，计算其抑制率；采用划痕法检测OA对U87MG细胞迁移能力的影响；用流式细胞仪分析OA对U87MG细胞周期与凋亡的影响；通过Westernblot检测OA对MAPK／ERK信号传导通路活性的影响。结果50μg/ml以上浓度的OA处理48h后，U87MG细胞的形态发生不同程度的变化，大量细胞脱落。150μg／ml和200μg／ml的OA处理U87MG细胞72h后，生长抑制率可达100％，与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．01）。25μg/ml的OA处理48h后，迁移至划痕区的细胞数量相比于对照组明显减少。经50μg/mlOA作用48h后，处于G0／G0期的细胞从64．23％上升至75．03％，说明发生G0／G1期阻滞。同一浓度下，细胞凋亡率达到18．77％。U87MG细胞中MEK和ERK蛋白的磷酸化水平受到明显的抑制。结论OA可显著抑制U87MG细胞的生长增殖，呈一定的量效关系；OA可明显抑制U87MG细胞的迁移，并能抑制MAPK／ERK信号传导通路的激活。OA通过抑制MAPK／ERK信号传导通路的激活，可以抑制神经胶质母细胞瘤细胞的增殖生长。

ADC患者体内HIV-1gp120基因的变异及其对U87细胞合成PDGF-BB与MCP-1的影响

目的 探讨HIV-1gp120在HIV-1入侵中枢神经系统(CNS)机制中的作用.方法 扩增1例艾滋病痴呆综合征(ADC)患者外周主动脉周淋巴结(PL)和CNS颞叶灰白质连接处(TGWJ)、脑室周围组织(PV)的HIV-1 gp120基因,测序并进行序列分析;构建真核表达载体pEGFP-gp120,在U87细胞中表达gp120蛋白,观察绿色荧光蛋白荧光强弱判断gp120表达;同时用免疫组化方法检测蛋白的表达,ELISA法检测U87细胞中血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的含量.结果 gp120基因序列分析结果显示,3个部位的HIV-1均为巨噬细胞嗜性,CNS来源的TGWJ和PV的HIV-1使用CCR5受体,与神经致病性有关.成功构建pEGFP-gp120表达载体,并在U87细胞中表达了gp120蛋白,转染后48 h蛋白表达量最高.ADC患者不同部位来源的gp120蛋白对U87细胞PDGF-BB水平无影响(P＞0.05),但能增强其MCP-1的分泌水平,且来自外周PL的gp120对MCP-1的升高作用较CNS更显著(P＜0.05).结论 ADC患者CNS gp120的变异提高了其对CNS环境的适应能力,与HIV的神经致病性有关;gp120蛋白可刺激U87细胞分泌MCP-1,而且外周来源的gp120作用较强,利于HIV-1入侵CNS.

上调miR-124-3p表达增加U-87 MG人胶质母细胞瘤细胞的放疗敏感性

目的探讨miR-124-3p表达水平对U-87 MG人胶质母细胞瘤细胞(U87细胞)放疗敏感性的影响。方法体外培养U87细胞,利用脂质体载体转染技术转染hsa-miR-124-3p mimics或hsa-miR-124-3p inhibitor质粒调控miR-124-3p表达;转染24 h后,取生长状态良好的U87细胞,在室温下用西门子Primus-M型直线加速器进行照射(16 Gy)模拟放疗;实时荧光定量PCR检测细胞miR-124-3p表达水平,CCK-8法检测细胞增殖能力。结果转染hsa-miR-124-3p mimics质粒后,细胞miR-124-3p表达水平明显上调(P<0.05);转染hsa-miR-124-3p inhibitoR质粒后,细胞miR-124-3p表达水平明显下调(P<0.05)。上调miR124-3p表达,U87细胞增殖活性明显降低(P<0.05);下调miR-124-3p表达,U-87细胞增殖活性明显增高(P<0.05)。上调miR124-3p表达联合放疗,U87细胞增殖活性进一步明显降低(P<0.05);下调miR-124-3p表达联合放疗,U87细胞增殖活性明显降低,但仍明显高于未给予任何处理的U87细胞的增殖活性(P<0.05)。结论上调miR-124-3p表达明显抑制U87细胞的增殖活性,并且显著增加U87细胞的放疗敏感性。

重组腺相关病毒感染细胞后目的蛋白表达水平检测方法的建立及验证

目的建立重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)感染细胞后目的蛋白表达水平的检测方法,并进行方法验证,以期用于rAAV9生产过程中不同阶段产物的质量监控。方法将rAAV9供试品用感染增强剂Envirus-AAV处理后,感染经羟基脲(hydroxyurea,HU)作用的人脑星形胶质母细胞瘤细胞U87-MG,以rAAV9参考品为标准,采用ELISA法检测细胞中目的蛋白戊二酰辅酶A脱氢酶(glutaryl-CoA dehydrogenase,GCDH)的表达水平,并验证方法的专属性、准确性、精密性、线性范围、定量限及耐用性。采用建立的方法检测8批rAAV9供试品。结果供试品缓冲液的A_(450)-A_(630)为0.3,略低于蛋白定量四参数标准曲线最低稀释点(1 ng/mL);150%、100%、50%理论相对效价水平样品平均回收率均在100.0%~107.3%范围内;同1名实验员重复3次及不同实验员检测3个理论相对效价水平样品的目的蛋白表达水平RSD均<25%;rAAV9供试品在50%~150%理论相对效价水平范围内,与相应的目的蛋白表达水平呈良好的线性关系,直线回归方程为y=1.077 x-0.022,R~2为0.984;方法的定量限为0.59,即6.0×10^(12)vg/mL;U87-MG细胞用HU孵育不同时间(18、21、24 h)、细胞培养上清液于不同条件(室温放置0.5 h、-60℃以下放置12 h、-60℃以下放置24 h)保存后,目的蛋白表达水平RSD均<25%。1~8批rAAV9供试品目的蛋白表达水平分别为111%、121%、72%、65%、86%、75%、102%、91%。结论建立的rAAV感染细胞后目的蛋白表达水平检测方法具有良好的专属性、准确性、精密性及耐用性,可用于rAAV9生产过程中不同阶段产物的质量监控。

转入EGFR cDNA对bcl-2及Bax在胶质母细胞瘤细胞内表达的影响

目的 探讨bcl 2及Bax蛋白与胶质母细胞瘤细胞系U87核基质的关系 ,以及导入EGFRcDNA对该蛋白在U87细胞内表达的影响。方法 运用共振聚焦显微镜、Western杂交方法分析bcl 2、Bax蛋白与U87细胞核基质的相关性 ,以及将EGFRcDNA转入U87细胞后bcl 2及Bax表达的改变。结果 bcl 2位于细胞核基质的周边 ,Bax位于核基质内。用Western杂交可在核基质蛋白内检测出一条 2 6 0 0 0的bcl 2带及一条约 6 6 0 0 0特异性Bax带。在EGFRcDNA转入的U87细胞中 ,Bax表达较对照组增强 ,而bcl 2的表达则较对照组减弱。结论 bcl 2及Bax蛋白是核基质相关蛋白。bcl 2及Bax基因可能参与EGFRcDNA所诱导的胶质母细胞瘤细胞的转化过程。