溶瘤新城疫病毒抑制IL-6诱导的人胶质母细胞瘤U87MG细胞的迁移和侵袭

目的:探讨溶瘤新城疫病毒(NDV)对IL-6诱导的人胶质母细胞瘤U87MG细胞增殖、迁移和侵袭的作用及其可能的机制。方法:将U87MG细胞分为对照组、IL-6组、NDV组、NDV+IL-6组,其中IL-6组与NDV+IL-6组用75 ng/mL IL-6预处理1 h,其余组用DMEM预处理1 h,后分别用DMEM、75 ng/mL IL-6、1 HU NDV、1 HU NDV+75 ng/mL IL-6处理24 h。MTT法、细胞划痕实验和Transwell侵袭实验分别检测IL-6、NDV对U87MG细胞增殖、迁移和侵袭的影响,WB法检测各组细胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和MMP2蛋白的表达水平。结果:与对照组相比,IL-6组细胞迁移率显著升高(P<0.05),侵袭细胞数目显著增多(P<0.01);与IL-6组相比,NDV+IL-6组U87MG细胞增殖率显著降低(P<0.05),细胞迁移率和侵袭细胞数目均显著降低(均P<0.01)。WB实验结果显示,与对照组相比,IL-6组p-STAT3/STAT3比值显著升高(P<0.01),NDV组p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值显著降低(P<0.05,P<0.01),MMP-2蛋白表达量显著降低(P<0.01);与IL-6组相比,NDV+IL-6组p-STAT3/STAT3比值、MMP-2蛋白表达量均显著降低(均P<0.05)。结论:NDV能抑制IL-6对人脑胶质瘤U87MG细胞迁移和侵袭的诱导作用,其机制可能与JAK2/STAT3信号通路的参与调控有关。

Leptin促进人脑胶质瘤U87MG细胞的迁移和侵袭

目的:探讨瘦素(leptin)对人脑胶质瘤U87MG细胞迁移及侵袭能力的影响及其机制。方法:Leptin处理U87MG细胞,采用细胞划痕实验检测U87MG细胞的迁移能力,Transwell实验检测U87MG细胞的侵袭能力,RT-PCR及Western blot-ting法检测U87MG细胞中MMP-2及MMP-9 mRNA和蛋白的表达。结果:Leptin明显促进U87MG细胞迁移能力[(152.42±3.29)vs(83.24±2.61)μm,P<0.05]和侵袭能力[(31.78±5.04)vs(17.03±2.41)个细胞,P<0.05],leptin能显著上调U87MG细胞中MMP-2、MMP-9 mRNA[(0.76±0.04)vs(0.35±0.02),(0.84±0.02)vs(0.41±0.06);均P<0.05]及蛋白[(0.79±0.03)vs(0.23±0.01),(0.81±0.05)vs(0.39±0.03);均P<0.05]的表达。MMP抑制剂GM6001(10μmol/ml)可以逆转leptin对U87MG细胞迁移[(82.05±2.98)vs(81.76±3.25)μm,P>0.05]和侵袭能力[(19.23±2.46)vs(18.02±1.98)个细胞,P>0.05]的影响。结论:Leptin可以促进人脑胶质瘤U87MG细胞的侵袭及迁移,其机制可能与上调MMP-2、MMP-9的表达有关。

积雪草酸通过抑制耐药相关蛋白表达增强U87MG胶质瘤细胞对紫杉醇的敏感性

目的:探索积雪草酸(asiatic acid,AA)对紫杉醇(paclitaxel,PTX)耐药性胶质瘤细胞的抑制作用及其可能的作用机制。方法:CCK-8实验、实时荧光定量PCR、Western blotting检测AA对成胶质细胞瘤U87MG细胞的增殖、凋亡的影响。浓度递增法构建PTX耐药性细胞株PR-U87MG,以U87MG细胞为对照,CCK-8实验验证PR-U87MG细胞对PTX的耐药性,实时荧光定量PCR、Western blotting检测PR-U87MG细胞中MDR1、LRP mRNA及蛋白的表达水平。AA和PTX单独或联合处理PR-U87MG细胞,CCK-8实验、实时荧光定量PCR、Western blotting检测各组细胞增殖活力及凋亡的变化。结果:成功构建PTX耐药性细胞株PR-U87MG。AA可以剂量依赖方式抑制U87MG细胞和PR-U87MG细胞的增殖活力(P<0.01),并明显促进其凋亡(P<0.01)。与AA或PTX单独处理组相比,联合处理组中PARP1的蛋白水平显著减少(P<0.01),caspase 3的裂解量显著增加(P<0.01),耐药相关蛋白P-糖蛋白1(P-dycoprotein 1,Pgp-1)和LRP表达水平显著减少(P<0.01)。结论:AA可有效增强U87MG胶质瘤细胞株对PTX的敏感性,其机制可能与AA抑制具有药物排出功能的耐药蛋白Pgp-1和LRP表达有关。

腺病毒介导IL-24基因诱导人脑胶质瘤U87MG细胞的凋亡

目的:研究腺病毒介导IL-24基因表达载体(Ad-IL-24)对人脑胶质瘤U87MG细胞的抑制作用,初步探讨其作用机制。方法:将本科室构建的Ad-IL-24感染U87MG细胞,RT-PCR法检测IL-24基因的表达,MTT法和流式细胞术检测U87MG细胞的生长和凋亡,激光共聚焦显微镜观察U87MG细胞凋亡的形态学变化,RT-PCR法检测Bax、Bcl-2基因mRNA的表达,Western blotting检测caspase-3的活化。结果:Ad-IL-24感染U87MG细胞后,IL-24在U87MG细胞中有明显表达,并抑制U87MG细胞生长、诱导其凋亡、出现典型的凋亡细胞核形态学改变。Ad-IL-24可上调U87MG细胞中Bax基因、下调Bcl-2基因的表达,并诱导caspase-3蛋白的活化。结论:Ad-IL-24可诱导U87MG细胞凋亡,其机制可能与上调Bax基因、下调Bcl-2基因表达,并活化caspase-3有关。

人脑胶质瘤中DNA拓扑异构酶-Ⅱα的表达及其对胶质瘤U87MG细胞凋亡的影响

目的研究DNA拓扑异构酶-Ⅱα(Topoisomerase-Ⅱα,Topo-Ⅱα)基因在人脑胶质瘤中的表达改变及其对胶质瘤U87MG细胞凋亡的影响。方法 Real-time PCR检测25例脑胶质瘤及相应癌旁组织中Topo-ⅡαmRNA的表达。将Topo-Ⅱα基因特异性的siRNA转染U87MG细胞。转染后,Western Blot检测转染后Topo-Ⅱα蛋白的表达,双标流式细胞法检测细胞凋亡率。结果与癌旁组织相比,Topo-ⅡαmRNA在脑胶质瘤组织中表达明显上调。转染后,U87MG细胞中的Topo-Ⅱα蛋白表达明显降低,同时,凋亡率明显增加。结论 Topo-Ⅱα基因在脑胶质瘤中存在表达异常,其表达降低能够促进细胞凋亡。

ADAM17对U87MG胶质瘤细胞增殖与侵袭的影响及作用机制

目的探讨ADAM17在U87MG细胞增殖与侵袭中的作用及机制。方法收集人脑胶质瘤组织65例(肿瘤组)与正常脑组织13例(对照组),采用免疫组化、RT-PCR法,检测ADAM17蛋白及mRNA的表达;利用siRNA干扰敲减或ADAM17激活剂(PMA)过表达ADAM17,并予以PI3K抑制剂抑制相关信号通路,MTT及Transwell实验检测各组U87MG细胞的增殖与侵袭变化,Western blot检测ADAM17、p-AKT及AKT蛋白变化。结果胶质瘤组织中ADAM17mRNA及蛋白水平均高于正常脑组织;与对照组相比,siRNA干扰后,低表达组U87MG细胞的增殖与侵袭能力下降,而激活剂PMA增强ADAM17后,过表达组细胞增殖与侵袭能力增加,差异有统计学意义(P<0.05);敲减及过表达ADAM17可导致PI3K/AKT信号通路下游蛋白发生变化。结果 ADAM17可通过激活PI3K/AKT信号通路促进U87MG细胞增殖与侵袭,有望为胶质瘤的治疗找到新突破点。

人参皂甙Rh2对人胶质瘤细胞U87MG凋亡的影响

目的观察人参皂甙Rh2对胶质瘤细胞凋亡的影响并初步探讨其可能机制。方法将培养的人胶质瘤细胞U87MG随机分为人参皂甙Rh2组、人参皂甙Rh2+尼莫地平组和对照组。人参皂甙Rh2组在常规培养细胞时加入20μg/ml的人参皂甙Rh2,人参皂甙Rh2+尼莫地平组在人参皂甙Rh2组培养细胞时加入浓度为10μmol/L的尼莫地平。利用流式细胞仪检测U87MG细胞凋亡,利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测U87MG细胞内钙离子浓度。结果与对照组相比,人参皂甙Rh2促进U87MG细胞凋亡(P<0.05),且增加细胞内游离钙离子浓度(P<0.05);尼莫地平显著减少人参皂甙Rh2引起的U87MG细胞凋亡(P<0.05)。结论人参皂甙Rh2可以通过增加细胞内游离钙离子浓度促进U87MG细胞凋亡。

稳定表达EGFRvIII的U87MG细胞株的建立与鉴定

目的:构建稳定表达表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)的U87MG细胞株。方法:采用电转染方法将pcD-NA4/TO-EGFRvⅢ质粒导入U87MG细胞,加入zeocin筛选,进一步将细胞有限稀释并克隆化培养以建立稳定的转染细胞株。应用RT-PCR、Western blot及细胞免疫荧光染色方法鉴定稳定表达EGFRvⅢ基因的细胞株。结果:经RT-PCR鉴定发现V6号和V24号单克隆细胞株EGFRvⅢ基因mRNA水平高表达,进一步Western blot及细胞免疫荧光染色方法鉴定发现V6号细胞株EGFRvⅢ蛋白水平高表达。结论:成功建立了稳定表达EGFRvⅢ的U87MG细胞株,为进一步的抗肿瘤治疗及其机制研究提供基础。

太白银莲花皂甙-1诱导胶质瘤U87MG细胞凋亡及机制研究

目的研究太白银莲花皂甙-1对人脑胶质母细胞瘤U87MG凋亡的影响,并探讨其可能的分子机制。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度不同时间(6、24、48、72 h)太白银莲花皂甙-1对U87MG细胞生长增殖的抑制作用;应用倒置显微镜和Hoehst荧光染色、末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法(TUNEL)、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(AnnexinV-FITC/PI)检测太白银莲花皂甙-1作用U87MG细胞后形态的变化和凋亡情况;通过免疫印迹法法检测太白银莲花皂甙-1处理后细胞凋亡相关蛋白Survivin及活化的Caspase-3的表达。结果太白银莲花皂甙-1可明显抑制U87MG细胞的增殖,诱导其凋亡;同时下调Survivin表达,激活了凋亡蛋白Activated Caspase-3的表达。结论体外实验显示,太白银莲花皂甙-1对U87MG细胞具有显著的增殖抑制作用,并能成功诱导人脑胶质母细胞瘤U87MG细胞发生凋亡,其机制可能与抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡有关。

免疫球蛋白G促进胶质瘤细胞系U87MG中PCNAP-ERK及P-SRC的表达

目的了解在体外培养条件下人源性免疫球蛋白G(IgG)刺激人胶质瘤细胞系U87MG后,对增殖细胞核抗原(PCNA)、激活的细胞外信号调节激酶(P-ERK)及激活的非受体酪氨酸激酶(P-SRC)表达的影响。方法用不同浓度的IgG(0.01、0.1、1μg/mL)刺激U87MG,24h后采用Western blot方法检测PCNA、ERK及P-ERK、SRC及P-SRC的表达变化情况。结果 IgG直接作用于体外培养的胶质瘤U87MG后,相对于对照组而言PCNA、P-ERK及P-SRC表达有明显的升高,并且表达呈现出一定的剂量依赖性。结论 IgG可能与神经系统癌症有关联。

早期生长反应因子对U87MG细胞Aβ40表达的影响

目的:研究早期生长因子EGR1对U87MG细胞Aβ40表达的影响。方法:构建EGR1表达质粒并转染U87MG(实验组),以转染空白质粒的U87MG细胞作为对照。采用qRT-PCR法检测两组EGR1 mRNA的表达;收集细胞培养液用ELISA法检测Aβ40的水平;提取总蛋白用蛋白印迹法检测BACE1和PS1蛋白的表达。结果:质粒成功构建并表达。实验组EGR1 mRNA表达水平较对照组明显增高(P<0.001);实验组细胞培养液中Aβ40水平较对照组增高(P<0.001);实验组BACE1蛋白的表达较对照组增加(P<0.001);两组PS1蛋白的表达差异无统计学意义(P=0.367)。结论:EGR1在体外可能使Aβ40表达增加,且可能与上调BACE1有关。

Nemo-like kinase（NLK）在胶质瘤细胞U87MG凋亡中作用的研究

目的 探讨Nemo-like kinase（NLK）在胶质瘤细胞U87MG凋亡中的作用.方法 建立NLK的过表达和小干扰质粒干扰NLK在胶质瘤细胞株U87MG中的表达.CCK-8和细胞免疫印迹的方法检测NLK和胶质瘤细胞U87MG凋亡指标caspase-3的关系.结果 构建的过表达和小干扰质粒能明显地影响NLK的表达.CCK-8和细胞免疫印迹的结果显示NLK能够诱导胶质瘤细胞U87MG的凋亡.结论 NLK能够通过激活经典的凋亡途径而诱导胶质瘤细胞U87MG的凋亡.

敲低胆碱激酶α(CHKA)抑制U87MG人胶质瘤细胞增殖和侵袭及迁移

目的检测胶质瘤组织胆碱激酶α(CHKA)的表达并进一步探讨敲低CHKA对U87MG人胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法采用实时定量PCR检测高级别胶质瘤组织和外伤脑组织CHKA的mRNA表达,Western blot法检测肿瘤组织和外伤组织CHKA蛋白表达。构建CHKA短发夹RNA(shCHKA)慢病毒及其对照慢病毒(shNC)并感染U87MG胶质瘤细胞,分为shCHKA组、载体对照组和空白对照组。CCK-8法检测U87MG细胞增殖,TranswellTM侵袭实验检测胶质瘤细胞侵袭能力,划痕愈合实验检测其迁移能力。结果胶质瘤组织中CHKA mRNA和蛋白高表达。敲低CHKA基因后,抑制U87MG胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。结论CHKA在胶质瘤组织中的表达量明显高于正常脑组织且下调CHKA可抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力,CHKA可能是一种促癌基因与胶质瘤的发生发展有关。

槐定碱抑制人胶质瘤U87MG细胞株增殖及其作用机制研究

目的探讨槐定碱抑制人胶质瘤U87恶性胶质瘤(U87MG)细胞株增殖作用及其相关机制。方法将各个浓度的槐定碱加入到人胶质瘤U87MG细胞株中,应用四唑氮盐比色法测定槐定碱对肿瘤细胞生长的抑制作用,流式细胞仪测定槐定碱对U87MG细胞凋亡和细胞周期的变化,生化检验测定肿瘤细胞内活性氧簇(ROS)和谷胱甘肽(GSH)含量,实时荧光定量聚合酶链式反应和蛋白免疫印迹法分别检测肿瘤相关基因mRNA表达和蛋白表达的变化,荧光素酶报告基因法检测肿瘤细胞中泛素-蛋白酶体、叉头盒蛋白M1(FoxM1)、核转录因子kappa B(NF-kb)、激活子蛋白-1(AP-1)的活性的变化。结果槐定碱能够显著抑制细胞增殖,阻滞细胞周期在G2/M期;诱导细胞凋亡,引起ROS产生和GSH含量减少;促使p27、周期蛋白依赖性激酶2、Survivin、Livin、B淋巴细胞瘤-2、E2启动子结合细胞因子1等基因表达下调,同时上调半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/8、p53、线粒体来源的第2个半胱氨酸蛋白酶激活剂、c-Jun氨基末端激酶和p38-丝裂原活化蛋白激酶等基因的表达;显著抑制泛素-蛋白酶体活性和FoxM1、NF-kb、AP-1的转录活性。结论槐定碱可能通过诱导细胞凋亡和ROS积聚,激活线粒体信号通路来发挥抗肿瘤活性。槐定碱能够作为一种新的药物来治疗胶质瘤。

PEDF对脑胶质瘤U87MG细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨色素上皮衍生因子(PEDF)对脑胶质瘤U87MG细胞增殖与凋亡的影响。方法分组培养U87MG细胞,对照组不添加PEDF蛋白,干预组分别添加80nmol/L、160nmol/L、320nmol/L的PEDF蛋白,采用MMT法检测不同时间点各组细胞增殖抑制率,采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率并进行比较。结果同一时间点,各浓度PEDF干预组的细胞增殖抑制率均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);各浓度PEDF干预组间比较差异均有统计学意义(P<0.05);相同浓度PEDF环境下,各时间点间细胞增殖抑制率差异亦有统计学意义(P<0.05)。随着PEDF浓度增高,U87MG细胞凋亡率呈增高趋势。结论 PEDF能够抑制脑胶质瘤U87MG细胞增殖并能促其凋亡,其抑制增殖水平与浓度、作用时间相关,促进凋亡水平与浓度相关。

新型^(18)F-RGD二聚体的正常生物分布及U87MG荷瘤裸鼠小动物PET/CT显像研究

背景与目的:整合素αvβ3受体在促进、维持以及调节血管生成的过程中有着至关重要的作用,高表达于多种肿瘤细胞及新生血管内皮细胞。RGD多肽序列可与整合素αvβ3受体特异性结合,有助于评价肿瘤的生长状况和侵袭性。本实验主要研究18F标记的RGD二聚体18F-E[c(RGDfK)2]在正常昆明小鼠体内的生物分布和荷人神经胶质瘤裸鼠模型的小动物PET/CT显像情况。方法:以硝基RGD二聚体4-NO2-3-TFMBz-E[c(RGDfK)2]为前体,使用改进的自动化合成模块Explora GN,一步法直接标记合成18F-E[c(RGDfK)2]。用昆明小鼠分析18F-E[c(RGDfK)2]0.5、1、2、4 h的生物分布,计算每克组织放射性占注入量的百分比(%ID/g)。观察荷人神经胶质瘤裸鼠模型1、2、4 h的小动物PET/CT显像情况。结果:18F-E[c(RGDfK)2]的标记率约为10%,放化纯度>98%,稳定性可达10 h。18F-E[c(RGDfK)2]主要经肾排泄,血液清除迅速,注射后1 h,肾、肝、小肠、肌肉和血的放射性摄取值分别为(1.02±0.16)%ID/g、(0.24±0.06)%ID/g、(0.35±0.03)%ID/g、(0.13±0.03)%ID/g和(0.11±0.03)%ID/g。注射后1 h,肿瘤对18F-E[c(RGDfK)2]的摄取达到高峰(5.2±0.56)%ID/g,T/M为5.36。阻断显像中,可见肿瘤组织放射性摄取明显减低,T/M平均值为1.57。结论:18F-E[c(RGDfK)2]与整合素受体特异性结合,肿瘤摄取较高、显像清晰,可用于整合素表达阳性肿瘤的预后判断、血管靶向治疗适应证的选择及疗效判断。

U87MG培养上清致Na觙ve CD4分化为Th2细胞的能力降低

目的肿瘤微环境或者肿瘤细胞本身对免疫细胞的分化具有定向诱导作用,本研究目的在于了解胶质瘤细胞株U87MG外泌分子对Na觙ve CD4细胞分化可能的影响。方法外周血PBMC中分离Na觙ve CD4细胞,U87MG培养液上清以1/5量加至Na觙veCD4细胞培养体系中,培养7 d,检测Na觙ve CD4细胞分化增殖情况以及分化为Th1、Th2、Th17、Treg四个亚群量的变化。结果加有1/5量U87MG培养上清的Na觙ve CD4细胞分化成Th2减低,较对照组有显著性差异8.17%±2.08%vs 9.63%±2.48%(P<0.05),Th1较对照组均值低,但无显著性差异,Th17、Treg细胞在2组之间无明显差异。结论观察到U87MG外泌分子Na觙ve CD4分化为Th2细胞能力减弱,同时初步观察了Na觙ve CD4细胞分化为其他亚群的变化规律,为理解肿瘤细胞对Na觙ve CD4细胞分化影响提供了实验基础。

Zwilch-siRNA抑制人脑胶质瘤U87MG细胞增殖

目的研究Zwilch-siRNA抑制U87MG细胞增殖的作用,探讨其在胶质瘤治疗中的潜在应用价值。方法应用靶向Zwilch基因两个作用靶点(59456-1,59460-1)的siRNA慢病毒感染U87MG细胞,采用荧光显微镜、Western blot观测感染效率及Zwilch蛋白表达的抑制效果。siRNA有效抑制Zwilch表达后,运用CCK-8和平板克隆实验检测U87MG细胞增殖及克隆形成能力的变化。结果携带针对U87MG细胞两个作用靶点的siRNA慢病毒均能够高效感染,并抑制Zwilch蛋白的表达水平(P均<0.001);与阴性对照组相比,siRNA靶向抑制Zwilch表达可减弱人脑胶质瘤U87MG细胞的增殖及克隆形成能力(P均<0.05)。结论siRNA靶向抑制Zwilch表达可抑制人脑胶质瘤U87MG细胞的增殖。

去甲斑蟊素对U87MG细胞增殖的影响

目的:探讨去甲斑蟊素对神经胶质瘤U87MG细胞生物学行为的影响。方法:用MTT法检测不同浓度的去甲斑蟊素对U87MG细胞增殖的抑制作用。用ELISA实验检测血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达水平。结果:MTT结果表明去甲斑蟊素对U87MG细胞的增殖有抑制作用,并随浓度增加抑制作用增强;ELISA实验提示去甲斑蟊素抑制U87MG细胞分泌VEGF蛋白。结论:去甲斑蟊素可以抑制U87MG细胞增殖,抑制肿瘤新生血管的形成。

TRPV2基因敲除对胶质瘤U87MG细胞增殖能力的影响

目的:探讨瞬时感受器电位离子通道蛋白V亚族2(TRPV2)基因敲除对胶质瘤U87MG细胞增殖及细胞周期进展的影响。方法:通过锌指核酶敲除U87MG细胞的TRPV2基因;Western Blot测定TRPV2蛋白的表达;Brdu掺入实验及Western Blot测定TRPV2基因敲除对U87MG细胞增殖的影响;流式细胞技术测定TRPV2基因敲除对U87MG细胞细胞周期进展的影响。结果:TRPV2蛋白在U87MG细胞中转录表达;靶向TRPV2的锌指核酶能有效地阻断U87MG细胞内TRPV2基因在蛋白水平上的表达。TRV2-/-U87MG细胞Brdu阳性率为(47.37±4.03)%,处于S期细胞的百分率为(20.14±0.47)%,均显著高于TRV2+/+U87MG细胞(P<0.01);PCNA表达量为U87MG TRV2+/+细胞的(1.47±0.19)倍(P<0.01)。结论:TRPV2基因敲除能明显促进U87MG细胞的增殖和细胞周期的进展。