溶瘤新城疫病毒抑制IL-6诱导的人胶质母细胞瘤U87MG细胞的迁移和侵袭

目的:探讨溶瘤新城疫病毒(NDV)对IL-6诱导的人胶质母细胞瘤U87MG细胞增殖、迁移和侵袭的作用及其可能的机制。方法:将U87MG细胞分为对照组、IL-6组、NDV组、NDV+IL-6组,其中IL-6组与NDV+IL-6组用75 ng/mL IL-6预处理1 h,其余组用DMEM预处理1 h,后分别用DMEM、75 ng/mL IL-6、1 HU NDV、1 HU NDV+75 ng/mL IL-6处理24 h。MTT法、细胞划痕实验和Transwell侵袭实验分别检测IL-6、NDV对U87MG细胞增殖、迁移和侵袭的影响,WB法检测各组细胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和MMP2蛋白的表达水平。结果:与对照组相比,IL-6组细胞迁移率显著升高(P<0.05),侵袭细胞数目显著增多(P<0.01);与IL-6组相比,NDV+IL-6组U87MG细胞增殖率显著降低(P<0.05),细胞迁移率和侵袭细胞数目均显著降低(均P<0.01)。WB实验结果显示,与对照组相比,IL-6组p-STAT3/STAT3比值显著升高(P<0.01),NDV组p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值显著降低(P<0.05,P<0.01),MMP-2蛋白表达量显著降低(P<0.01);与IL-6组相比,NDV+IL-6组p-STAT3/STAT3比值、MMP-2蛋白表达量均显著降低(均P<0.05)。结论:NDV能抑制IL-6对人脑胶质瘤U87MG细胞迁移和侵袭的诱导作用,其机制可能与JAK2/STAT3信号通路的参与调控有关。

槐定碱抑制人胶质瘤U87MG细胞株增殖及其作用机制研究

目的探讨槐定碱抑制人胶质瘤U87恶性胶质瘤(U87MG)细胞株增殖作用及其相关机制。方法将各个浓度的槐定碱加入到人胶质瘤U87MG细胞株中,应用四唑氮盐比色法测定槐定碱对肿瘤细胞生长的抑制作用,流式细胞仪测定槐定碱对U87MG细胞凋亡和细胞周期的变化,生化检验测定肿瘤细胞内活性氧簇(ROS)和谷胱甘肽(GSH)含量,实时荧光定量聚合酶链式反应和蛋白免疫印迹法分别检测肿瘤相关基因mRNA表达和蛋白表达的变化,荧光素酶报告基因法检测肿瘤细胞中泛素-蛋白酶体、叉头盒蛋白M1(FoxM1)、核转录因子kappa B(NF-kb)、激活子蛋白-1(AP-1)的活性的变化。结果槐定碱能够显著抑制细胞增殖,阻滞细胞周期在G2/M期;诱导细胞凋亡,引起ROS产生和GSH含量减少;促使p27、周期蛋白依赖性激酶2、Survivin、Livin、B淋巴细胞瘤-2、E2启动子结合细胞因子1等基因表达下调,同时上调半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/8、p53、线粒体来源的第2个半胱氨酸蛋白酶激活剂、c-Jun氨基末端激酶和p38-丝裂原活化蛋白激酶等基因的表达;显著抑制泛素-蛋白酶体活性和FoxM1、NF-kb、AP-1的转录活性。结论槐定碱可能通过诱导细胞凋亡和ROS积聚,激活线粒体信号通路来发挥抗肿瘤活性。槐定碱能够作为一种新的药物来治疗胶质瘤。

Leptin促进人脑胶质瘤U87MG细胞的迁移和侵袭

目的:探讨瘦素(leptin)对人脑胶质瘤U87MG细胞迁移及侵袭能力的影响及其机制。方法:Leptin处理U87MG细胞,采用细胞划痕实验检测U87MG细胞的迁移能力,Transwell实验检测U87MG细胞的侵袭能力,RT-PCR及Western blot-ting法检测U87MG细胞中MMP-2及MMP-9 mRNA和蛋白的表达。结果:Leptin明显促进U87MG细胞迁移能力[(152.42±3.29)vs(83.24±2.61)μm,P<0.05]和侵袭能力[(31.78±5.04)vs(17.03±2.41)个细胞,P<0.05],leptin能显著上调U87MG细胞中MMP-2、MMP-9 mRNA[(0.76±0.04)vs(0.35±0.02),(0.84±0.02)vs(0.41±0.06);均P<0.05]及蛋白[(0.79±0.03)vs(0.23±0.01),(0.81±0.05)vs(0.39±0.03);均P<0.05]的表达。MMP抑制剂GM6001(10μmol/ml)可以逆转leptin对U87MG细胞迁移[(82.05±2.98)vs(81.76±3.25)μm,P>0.05]和侵袭能力[(19.23±2.46)vs(18.02±1.98)个细胞,P>0.05]的影响。结论:Leptin可以促进人脑胶质瘤U87MG细胞的侵袭及迁移,其机制可能与上调MMP-2、MMP-9的表达有关。

腺病毒介导IL-24基因诱导人脑胶质瘤U87MG细胞的凋亡

目的:研究腺病毒介导IL-24基因表达载体(Ad-IL-24)对人脑胶质瘤U87MG细胞的抑制作用,初步探讨其作用机制。方法:将本科室构建的Ad-IL-24感染U87MG细胞,RT-PCR法检测IL-24基因的表达,MTT法和流式细胞术检测U87MG细胞的生长和凋亡,激光共聚焦显微镜观察U87MG细胞凋亡的形态学变化,RT-PCR法检测Bax、Bcl-2基因mRNA的表达,Western blotting检测caspase-3的活化。结果:Ad-IL-24感染U87MG细胞后,IL-24在U87MG细胞中有明显表达,并抑制U87MG细胞生长、诱导其凋亡、出现典型的凋亡细胞核形态学改变。Ad-IL-24可上调U87MG细胞中Bax基因、下调Bcl-2基因的表达,并诱导caspase-3蛋白的活化。结论:Ad-IL-24可诱导U87MG细胞凋亡,其机制可能与上调Bax基因、下调Bcl-2基因表达,并活化caspase-3有关。

人脑胶质瘤中DNA拓扑异构酶-Ⅱα的表达及其对胶质瘤U87MG细胞凋亡的影响

目的研究DNA拓扑异构酶-Ⅱα(Topoisomerase-Ⅱα,Topo-Ⅱα)基因在人脑胶质瘤中的表达改变及其对胶质瘤U87MG细胞凋亡的影响。方法 Real-time PCR检测25例脑胶质瘤及相应癌旁组织中Topo-ⅡαmRNA的表达。将Topo-Ⅱα基因特异性的siRNA转染U87MG细胞。转染后,Western Blot检测转染后Topo-Ⅱα蛋白的表达,双标流式细胞法检测细胞凋亡率。结果与癌旁组织相比,Topo-ⅡαmRNA在脑胶质瘤组织中表达明显上调。转染后,U87MG细胞中的Topo-Ⅱα蛋白表达明显降低,同时,凋亡率明显增加。结论 Topo-Ⅱα基因在脑胶质瘤中存在表达异常,其表达降低能够促进细胞凋亡。

人参皂甙Rh2对人胶质瘤细胞U87MG凋亡的影响

目的观察人参皂甙Rh2对胶质瘤细胞凋亡的影响并初步探讨其可能机制。方法将培养的人胶质瘤细胞U87MG随机分为人参皂甙Rh2组、人参皂甙Rh2+尼莫地平组和对照组。人参皂甙Rh2组在常规培养细胞时加入20μg/ml的人参皂甙Rh2,人参皂甙Rh2+尼莫地平组在人参皂甙Rh2组培养细胞时加入浓度为10μmol/L的尼莫地平。利用流式细胞仪检测U87MG细胞凋亡,利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测U87MG细胞内钙离子浓度。结果与对照组相比,人参皂甙Rh2促进U87MG细胞凋亡(P<0.05),且增加细胞内游离钙离子浓度(P<0.05);尼莫地平显著减少人参皂甙Rh2引起的U87MG细胞凋亡(P<0.05)。结论人参皂甙Rh2可以通过增加细胞内游离钙离子浓度促进U87MG细胞凋亡。

稳定表达EGFRvIII的U87MG细胞株的建立与鉴定

目的:构建稳定表达表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)的U87MG细胞株。方法:采用电转染方法将pcD-NA4/TO-EGFRvⅢ质粒导入U87MG细胞,加入zeocin筛选,进一步将细胞有限稀释并克隆化培养以建立稳定的转染细胞株。应用RT-PCR、Western blot及细胞免疫荧光染色方法鉴定稳定表达EGFRvⅢ基因的细胞株。结果:经RT-PCR鉴定发现V6号和V24号单克隆细胞株EGFRvⅢ基因mRNA水平高表达,进一步Western blot及细胞免疫荧光染色方法鉴定发现V6号细胞株EGFRvⅢ蛋白水平高表达。结论:成功建立了稳定表达EGFRvⅢ的U87MG细胞株,为进一步的抗肿瘤治疗及其机制研究提供基础。

太白银莲花皂甙-1诱导胶质瘤U87MG细胞凋亡及机制研究

目的研究太白银莲花皂甙-1对人脑胶质母细胞瘤U87MG凋亡的影响,并探讨其可能的分子机制。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度不同时间(6、24、48、72 h)太白银莲花皂甙-1对U87MG细胞生长增殖的抑制作用;应用倒置显微镜和Hoehst荧光染色、末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法(TUNEL)、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(AnnexinV-FITC/PI)检测太白银莲花皂甙-1作用U87MG细胞后形态的变化和凋亡情况;通过免疫印迹法法检测太白银莲花皂甙-1处理后细胞凋亡相关蛋白Survivin及活化的Caspase-3的表达。结果太白银莲花皂甙-1可明显抑制U87MG细胞的增殖,诱导其凋亡;同时下调Survivin表达,激活了凋亡蛋白Activated Caspase-3的表达。结论体外实验显示,太白银莲花皂甙-1对U87MG细胞具有显著的增殖抑制作用,并能成功诱导人脑胶质母细胞瘤U87MG细胞发生凋亡,其机制可能与抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡有关。

早期生长反应因子对U87MG细胞Aβ40表达的影响

目的:研究早期生长因子EGR1对U87MG细胞Aβ40表达的影响。方法:构建EGR1表达质粒并转染U87MG(实验组),以转染空白质粒的U87MG细胞作为对照。采用qRT-PCR法检测两组EGR1 mRNA的表达;收集细胞培养液用ELISA法检测Aβ40的水平;提取总蛋白用蛋白印迹法检测BACE1和PS1蛋白的表达。结果:质粒成功构建并表达。实验组EGR1 mRNA表达水平较对照组明显增高(P<0.001);实验组细胞培养液中Aβ40水平较对照组增高(P<0.001);实验组BACE1蛋白的表达较对照组增加(P<0.001);两组PS1蛋白的表达差异无统计学意义(P=0.367)。结论:EGR1在体外可能使Aβ40表达增加,且可能与上调BACE1有关。

免疫球蛋白G促进胶质瘤细胞系U87MG中PCNAP-ERK及P-SRC的表达

目的了解在体外培养条件下人源性免疫球蛋白G(IgG)刺激人胶质瘤细胞系U87MG后,对增殖细胞核抗原(PCNA)、激活的细胞外信号调节激酶(P-ERK)及激活的非受体酪氨酸激酶(P-SRC)表达的影响。方法用不同浓度的IgG(0.01、0.1、1μg/mL)刺激U87MG,24h后采用Western blot方法检测PCNA、ERK及P-ERK、SRC及P-SRC的表达变化情况。结果 IgG直接作用于体外培养的胶质瘤U87MG后,相对于对照组而言PCNA、P-ERK及P-SRC表达有明显的升高,并且表达呈现出一定的剂量依赖性。结论 IgG可能与神经系统癌症有关联。

敲低胆碱激酶α(CHKA)抑制U87MG人胶质瘤细胞增殖和侵袭及迁移

目的检测胶质瘤组织胆碱激酶α(CHKA)的表达并进一步探讨敲低CHKA对U87MG人胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法采用实时定量PCR检测高级别胶质瘤组织和外伤脑组织CHKA的mRNA表达,Western blot法检测肿瘤组织和外伤组织CHKA蛋白表达。构建CHKA短发夹RNA(shCHKA)慢病毒及其对照慢病毒(shNC)并感染U87MG胶质瘤细胞,分为shCHKA组、载体对照组和空白对照组。CCK-8法检测U87MG细胞增殖,TranswellTM侵袭实验检测胶质瘤细胞侵袭能力,划痕愈合实验检测其迁移能力。结果胶质瘤组织中CHKA mRNA和蛋白高表达。敲低CHKA基因后,抑制U87MG胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。结论CHKA在胶质瘤组织中的表达量明显高于正常脑组织且下调CHKA可抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力,CHKA可能是一种促癌基因与胶质瘤的发生发展有关。

PEDF对脑胶质瘤U87MG细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨色素上皮衍生因子(PEDF)对脑胶质瘤U87MG细胞增殖与凋亡的影响。方法分组培养U87MG细胞,对照组不添加PEDF蛋白,干预组分别添加80nmol/L、160nmol/L、320nmol/L的PEDF蛋白,采用MMT法检测不同时间点各组细胞增殖抑制率,采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率并进行比较。结果同一时间点,各浓度PEDF干预组的细胞增殖抑制率均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);各浓度PEDF干预组间比较差异均有统计学意义(P<0.05);相同浓度PEDF环境下,各时间点间细胞增殖抑制率差异亦有统计学意义(P<0.05)。随着PEDF浓度增高,U87MG细胞凋亡率呈增高趋势。结论 PEDF能够抑制脑胶质瘤U87MG细胞增殖并能促其凋亡,其抑制增殖水平与浓度、作用时间相关,促进凋亡水平与浓度相关。

TRPV2基因敲除对胶质瘤U87MG细胞增殖能力的影响

目的:探讨瞬时感受器电位离子通道蛋白V亚族2(TRPV2)基因敲除对胶质瘤U87MG细胞增殖及细胞周期进展的影响。方法:通过锌指核酶敲除U87MG细胞的TRPV2基因;Western Blot测定TRPV2蛋白的表达;Brdu掺入实验及Western Blot测定TRPV2基因敲除对U87MG细胞增殖的影响;流式细胞技术测定TRPV2基因敲除对U87MG细胞细胞周期进展的影响。结果:TRPV2蛋白在U87MG细胞中转录表达;靶向TRPV2的锌指核酶能有效地阻断U87MG细胞内TRPV2基因在蛋白水平上的表达。TRV2-/-U87MG细胞Brdu阳性率为(47.37±4.03)%,处于S期细胞的百分率为(20.14±0.47)%,均显著高于TRV2+/+U87MG细胞(P<0.01);PCNA表达量为U87MG TRV2+/+细胞的(1.47±0.19)倍(P<0.01)。结论:TRPV2基因敲除能明显促进U87MG细胞的增殖和细胞周期的进展。

黑骨藤对高表达表皮生长因子受体突变体Ⅲ的人胶质母细胞瘤细胞DKMG的影响及机制

目的探讨黑骨藤对高表达表皮生长因子(EGF)受体突变体Ⅲ(EGFRvⅢ)的人胶质母细胞瘤细胞DKMG的影响及其机制。方法取对数生长期的DKMG和不表达EGFRvⅢ的人脑星形胶质母细胞瘤细胞U87MG,各自分为空白(Con)组(DMEM培养液)、低浓度黑骨藤组(100 mg/L黑骨藤培养液)、中浓度黑骨藤组(200 mg/L黑骨藤培养液)及高浓度黑骨藤组(400 mg/L黑骨藤培养液),处理细胞24 h,采用细胞增殖与毒力检测试剂盒(MTS)检测各组DKMG、U87MG细胞的存活率,采用流式细胞术检测各组DKMG细胞凋亡率;实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(qRT-PCR)检测各组DKMG细胞中EGFRvⅢ、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)及BCL2-Associated X(Bax)的信使核糖核酸(mRNA)表达,采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组DKMG细胞中EGFRvⅢ、Bcl-2、Bax、半胱氨酸蛋酶家族(Caspase-3、Cleaved caspase-3)蛋白的表达。结果MTS检测显示,与Con组相比,各浓度黑骨藤组DKMG细胞存活率明显降低(P<0.05),各浓度黑骨藤组U87MG细胞存活率比较、差异无统计学意义(P>0.05);流式细胞术结果表明,与Con组比较,各浓度黑骨藤组DKMG细胞凋亡率明显增加(P<0.05);qRT-PCR结果表明,与Con组比较,各浓度黑骨藤组DKMG细胞中EGFRvⅢ和Bcl-2 mRNA表达降低(P<0.05),Bax表达无变化(P>0.05);Western blot结果显示,各浓度黑骨藤组DKMG细胞中EGFRvⅢ、Bcl-2及Caspase-3蛋白表达下降(P<0.05),Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达升高(P<0.05)。结论黑骨藤可诱发DKMG细胞凋亡,产生细胞杀伤作用,其机制可能与下调EGFRvⅢ、Bcl-2、Caspase-3表达及上调Bax、Cleaved caspase-3表达有关。

CBX8过表达或沉默对人神经胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的:探究染色质结构域蛋白8(chromodomain protein 8,CBX8)对人神经胶质瘤细胞增殖与凋亡的作用。方法:Western blot和RT-qPCR检测组织及细胞系中CBX8的表达。构建过表达CBX8和沉默CBX8载体,转染神经胶质瘤细胞T98G和U87MG,分别用MTT法和BrdU实验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。结果:与正常脑组织和星形胶质细胞相比,神经胶质瘤组织及细胞中的CBX8蛋白和mRNA水平明显上升。在T98G和U87MG细胞中,过表达CBX8均促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,并上调Rb/E2F1的表达水平,而沉默CBX8则作用相反。sh-E2F1转染细胞之后,cyclin D1的表达以及Bcl-2/Bax的比值降低。结论:CBX8可能通过Rb/E2F1通路调节胶质瘤细胞的增殖和凋亡。

长链非编码RNA-TP53TG1在神经胶质瘤细胞中对糖剥夺应激反应的影响

目的构建长链非编码RNA-TP53TG1的真核表达克隆,并探索其在神经胶质瘤中对糖剥夺应激反应的影响。方法用RT-PCR方法从人胶质瘤细胞中扩增出TP53TG1;构建了TP53TG1的全长真核表达克隆;实时定量PCR检测其在U87MG细胞内的表达;同时用低糖(0.3 g/L葡萄糖、8 h)处理;real-time PCR检测GRP78、IDH1和PKM2的表达水平。结果成功构建了真核重组表达质粒pCIG-TP53TG1;在转染U87MG细胞36 h后,可见绿色荧光的表达,U87MG细胞中TP53TG1 mRNA升高了2.9×106倍(P<0.05);过表达TP53TG1的同时低糖处理,GRP78和IDH1 mRNA的表达水平显著升高(P<0.05),而PKM2 mRNA的表达水平显著降低(P<0.05)。结论在U87MG细胞中,TP53TG1可能通过影响GRP78、IDH1和PKM2 mRNA的表达,而参与到对糖剥夺的应激反应过程。

热休克蛋白90靶向抑制剂多肽P7联合替莫唑胺协同抗胶质母细胞瘤的作用

目的探讨双功能小分子多肽P7(序列LPLTPLP)联合替莫唑胺(TMZ)对人胶质母细胞瘤细胞系U87MG的影响。方法以TMZ与P7单用或联用处理U87MG细胞,采用CCK-8法检测细胞活性,流式细胞术检测U87MG细胞凋亡水平,蛋白质免疫印迹法检测U87MG细胞凋亡相关蛋白水平。以溶剂作对照。结果TMZ和P7均能抑制U87MG细胞的生长,当P7与TMZ浓度比为1∶1时,协同作用最明显;与对照组比较,联合给药组的U87MG细胞凋亡率显著升高(P<0.01),cleaved caspase-9和cleaved caspase-3表达水平显著升高(P<0.05)。结论P7联合TMZ能协同抑制U87MG细胞活力,并促进其凋亡,其机制可能与显著上调促凋亡蛋白cleaved caspase-9和cleaved caspase-3水平有关。

熊果酸通过抑制Akt通路诱导胶质瘤细胞凋亡

目的探讨熊果酸对胶质瘤细胞系U87MG细胞增殖和凋亡的影响,并分析可能的作用机制。方法体外培养的U87MG细胞,用不同浓度熊果酸(浓度0、10、20、40、80、100μmol/L)处理24、48、72h,MTT法测定其对U87MG细胞增殖的影响;熊果酸(浓度分别为0、20、40、80μmol/L)处理U87MG细胞48h后,分别采用流式细胞仪检测细胞凋亡率,分光光度法检测细胞Caspase-3活性;Western blot法检测Akt、p-Akt,p-GSK-3β、Bax及Bcl-2的表达。结果熊果酸对U87MG细胞的增殖具有抑制作用,且呈剂量、时间依赖性;U87MG细胞经熊果酸作用48h后,细胞凋亡率从14.8%上升至37.7%;Bax表达上调,而Bcl-2表达下调;细胞Caspase-3活性显著升高;且熊果酸可抑制p-Akt及其下游蛋白p-GSK-3β的表达。结论熊果酸对U87MG细胞增殖具有抑制作用,并可促进细胞凋亡,其抗肿瘤作用机制可能与抑制Akt信号通路激活,继而上调Bax并下调Bcl-2,并增加Caspase-3活性有关。

荧光素酶表达的脑胶质瘤小鼠模型的建立

运用PiggyBac转座子系统,通过嘌呤霉素筛选构建稳定表达荧光素酶的U87MG细胞株(U87MG-FLUC)。通过流式细胞术检测U87MG-FLUC细胞株纯度达到100%。该细胞系传代后能稳定表达荧光素酶,且生物发光的强度与细胞个数成正比。将该稳定表达荧光素酶的细胞接种于免疫缺陷型小鼠的颅内,肿瘤接种后的7 d,利用活体成像仪对植瘤小鼠进行检测,确定肿瘤的大小以及位置。结果表明:接种了U87MG-FLUC细胞的裸鼠,均长出肿瘤;成功构建了表达荧光素酶的U87MG细胞株,且人脑胶质瘤细胞系的裸鼠肿瘤模型构建成功。

姜黄素对U87MG细胞体外生长及血管生成拟态的影响

目的观察姜黄素对人恶性胶质瘤细胞体外生长及血管生成拟态的影响及姜黄素的干预作用。方法培养细胞,普通显微镜下观察姜黄素对U87MG细胞血管生成拟态的影响,MTT法筛选姜黄素最佳浓度后将其分为4组,采用免疫细胞化学技术、WestenBlot技术检测相关蛋白的表达情况,PCR技术检测基因表达变化。结果人恶性胶质母细胞瘤细胞体外培养时可发生血管生成拟态现象,姜黄素干预后血管生成拟态现象不明显,VE-cadherin/EphA2/PI3K/MMP-2细胞信号转导通路中各因子蛋白和mRNA的表达下降。结论姜黄素可能通过影响VE-cadherin/EphA2/PI3K/MMP-2细胞信号转导通路中各因子干预血管生成拟态现象,从而达到抑制胶质母细胞瘤生长的作用。