巴西橡胶树HbUBC22基因克隆与表达分析

泛素蛋白酶体途径(UPP)广泛参与植物生长发育相关过程的调控,巴西橡胶树UPP关键酶-泛素结合酶UBC/E2基因的克隆及其表达分析,将为进一步研究UPP在橡胶树中的功能奠定基础。本研究通过同源克隆法,根据巴西橡胶树UBC22同源EST序列进行拼接设计特异引物,利用RT-PCR扩增从橡胶树中克隆UBC22基因,利用生物信息学的方法对基因的结构进行分析,进一步采用Q-PCR技术分析基因表达模式,并在大肠杆菌中表达目标蛋白。将克隆的基因命名为HbUBC22,该基因的开放阅读框(ORF)共807bp,编码268个氨基酸,编码蛋白含有1个保守的UBC结构域和半胱氨酸催化位点。HbUBC22蛋白与蓖麻、杨树、油茶和葡萄的UBC蛋白同源性最高,分别为89%、85%、85%和81%。HbUBC22受乙烯利和茉莉酸甲酯诱导显著上调表达。经IPTG诱导后,HbUBC22能够在大肠杆菌中表达出目标蛋白。通过对HbUBC22的克隆及其序列分析可知,该基因属于泛素结合酶UBC/E2家族成员,以上研究结果为进一步研究HbUBC22的生物学功能奠定了良好的基础。

哈茨木霉UBc基因的克隆及表达

筛选哈茨木霉的cDNA文库,克隆到泛素结合酶基因的cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析,该序列的长度为951 bp,包含一个455 bp的完整开放阅读框,编码157个氨基酸,其理论分子量为17.64ku.在氨基酸水平上,具有较高的保守性.以克隆载体pBK5313为模板,设计含有XhoI和BamH I酶切位点的引物,成功地获得包含完整阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上,构建出含有泛素结合酶基因的重组子pET28-UBc,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,成功地获得了大量的大肠杆菌转化子.通过对大肠杆菌转化子菌落PCR检验、质粒双酶切鉴定及测序分析,证实了成功转化.通过IPTG诱导,优化了泛素结合酶原核表达的条件,最佳诱导时间为4 h,诱导剂浓度对蛋白表达量影响不大.本研究为进一步研究哈茨木霉的生物防治作用机制,诠释蛋白质代谢途径提供基本技术支持.

松材线虫泛素结合酶基因家族生物信息学与表达分析

松材线虫引起的松材线虫病对东亚、欧洲等多个国家和地区的松科植物破坏严重,威胁着世界森林生态系统的稳定发展。泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzyme,UBCs)通过蛋白酶体降解靶蛋白,在生物体生长发育及逆境胁迫应答等方面发挥着重要作用。通过松材线虫基因组分析获得了20个泛素结合酶家族成员,对不同发育状态的松材线虫泛素结合酶家族基因进行理化性质、蛋白结构及在松材线虫发育过程中表达水平分析。结果表明,基因染色体定位结果显示,泛素结合酶基因均匀分布于除第5条染色体外的其余染色体上。基因拓扑分析显示大部分泛素结合酶基因位于细胞内,基因结构分析显示泛素结合酶基因主要由2~8个外显子组成。外显子-内含子结构在进化上高度保守,与氨基酸序列的多态性一致,且在外显子上存在密码子偏好性。基因表达数据显示,泛素结合酶家族成员在不同生长发育状态中存在差异性表达。通过生物信息学和基因表达分析方法初步了解泛素结合酶在松材线虫的生长发育过程中所扮演的角色,对于了解松材线虫发育机制和构建分子防治靶标具有重要的指导意义和理论价值。