欧亚种葡萄花色素苷的积累及UFGT基因的RT-PCR表达分析

以欧亚种葡萄为试材,研究南方设施栽培条件下果实中花色素苷的积累与着色。结果表明,转熟期花色素苷开始积累,果实颜色由绿转红直至成熟,其积累的花色素苷以单糖苷类为主,不同于欧美杂交种,品种间花色素苷组分也存在差异。设施条件下与离体培养结果均表明外源应用ABA和鼠李糖能够促进欧亚种葡萄红地球果实花色素苷的积累,芍药色素糖苷含量增加显著,蔗糖则起抑制作用。半定量RT-PCR分析显示,葡萄糖类黄酮转移酶RGufgt基因(GenBank:DQ513314)在葡萄幼叶中表达,在绿果时不表达,果实转熟着色后即开始表达,直至果实成熟,同花色素苷积累过程完全一致。

‘红巴梨’果皮UFGT基因的克隆及表达分析

以‘巴梨’红色芽变品种‘红巴梨’果皮为材料,采用同源克隆技术和RACE结合的方法,克隆了UFGT(UDP-葡萄糖:类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶)蛋白的部分cDNA,命名为Pc UFGT。结果表明:该cDNA片段长为1 089 bp,与苹果UFGT基因序列一致性达89%,氨基酸序列同源性为85%,含有糖基转移酶的UDPGT、COG1819和MGT等保守域。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在‘红巴梨’幼果期表达强度约为‘巴梨’的2倍,而果实成熟期表达强度略低于‘巴梨’;该基因在‘红巴梨’果肉中不表达。

荔枝类黄酮糖基转移酶(UFGT)基因的克隆及其原核表达研究

类黄酮糖基转移酶(UFGT)可以把不稳定的花色素催化成花色素苷,是花色素苷合成过程中的最后一个酶。在一定范围内,类黄酮糖基转移酶活性与花色素苷的合成呈现正相关,抑制UFGT酶活性比抑制其他酶更能影响花色素苷的合成。很多研究结果表明,UFGT是花色素苷合成的关键酶基因。本研究根据在荔枝上已知的UFGT基因片段,采用3′RACE和5′RACE技术克隆得到UFGT的全长cDNA。采用特异引物扩增得到该基因的基因组DNA的全长序列,发现该基因含有一个内含子。将该基因全长cDNA序列构建到原核表达载体pET32a中,通过1 mmol/L IPTG诱导表达,得到大约60 KDa的融合蛋白。

葡萄浆果着色与UFGT和MYBA基因表达量的关系研究

以避雨栽培条件下葡萄品种的‘京秀’‘巨星’‘甬优一号’和‘藤稔’为试验材料,分析了葡萄浆果着色差异的原因并进行相关分析,同时调查研究了这4个品种葡萄浆果生长发育过程中的主要性状指标以及果皮色泽的变化规律,并对花色苷合成相关重要基因的表达进行了分析。结果表明:4个品种葡萄果穗先着色的部位是果穗肩部,果粒先着色的部位是果粒尖部和中部。在葡萄成熟过程中,4个品种葡萄果面光泽明亮度(L*值)和颜色组分b*值均下降,颜色组分a*值以及红色葡萄果实颜色指数(CIRG)均增大。同时,4个品种葡萄的花色苷含量与其可溶性固形物及CIRG均呈正相关,‘京秀’‘巨星’‘藤稔’和‘甬优一号’的可溶性固形物含量与花色苷含量的相关系数分别为0.804 4、0.953 4、0.932 4和0.911 6;CIRG与花色苷含量的相关系数分别为0.821 0、0.946 0、0.996 6和0.856 9。基因表达结果显示,4个葡萄品种的UDP-类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因(UFGT)均在成熟时表达最高,MYBA1和MYBA2基因的表达量则在转色到成熟中后期较高。

刺葡萄愈伤组织UFGT基因克隆及表达分析

为从细胞水平上揭示刺葡萄3-O-类黄酮葡萄糖基转移酶(UFGT)基因调控花青素合成的功能,以刺葡萄愈伤组织为试验材料,根据刺葡萄愈伤组织转录组UFGT序列片段,利用RT-PCR结合RACE技术克隆得到VdUFGT基因,并对其进行生物信息学和表达特性分析。结果表明,VdUFGT基因cDNA和DNA开放阅读框(ORF)分别为1 371 bp和1 448 bp,包含2个外显子和1个内含子,编码456个氨基酸,为带负电荷的不稳定的亲水性蛋白,具有一个UDPGT结构域,是UDPGT超家族成员,包含UDP-黄酮糖基转移酶特征区域。由UFGT同源基因编码蛋白所构建的系统发育树,与植物进化的关系相一致,6个葡萄属植物聚为一支。RT-qPCR分析表明,刺葡萄红色愈伤组织VdUFGT转录水平极显著高于白色愈伤组织,培养25 d的2个细胞培养物差异可达79倍;在刺葡萄愈伤组织连续培养过程中,红色愈伤组织中Vd UFGT转录水平变化幅度较大,在愈伤组织快速生长中期和衰老初期分别出现峰值,而刺葡萄白色愈伤组织VdUFGT转录水平与红色愈伤组织相比变化幅度不大,且始终维持在一个较低的水平。说明VdUFGT对刺葡萄红色愈伤组织细胞培养物中的花青素生物合成有重要的调控作用,这种调控作用主要发生在刺葡萄愈伤组织细胞快速生长中期和细胞衰老初期。本研究结果为进一步阐明VdUFGT调控刺葡萄细胞花青素合成的机制奠定了理论基础。

洋葱UFGT基因的克隆和表达分析

为了研究洋葱UFGT基因的生物学功能及其与花青素合成之间的关系,通过简并PCR技术和RACE技术克隆了2条洋葱UFGT基因全长c DNA序列Ac UFGT1和Ac UFGT2。序列分析表明,这2个基因编码450和475个氨基酸残基组成的多肽链,包含糖基转移酶的保守序列PSPG框,且分别与美洲葡萄和烟草UFGT蛋白相似性较高;系统进化分析表明,它们分别与海枣及二穗短柄草的亲缘关系较近,但是二者的亲缘关系却较远;表达分析表明,这2个基因均在红皮洋葱鳞茎中大量表达,在黄皮和白皮洋葱中几乎不表达;在鳞茎膨大初期表达量最大,并在之后表达量缓慢降低,不同的是Ac UFGT2在鳞茎膨大后期缓慢上升;花青素含量测定发现红皮洋葱中含量最高,黄皮、白皮洋葱含量很低,而鳞茎膨大初期大量积累、之后缓慢积累、最后稍有下降。本研究初步证明了这2个UFGT基因与洋葱花青素合成有关系,为进一步探究洋葱花青素的生物合成途径提供了理论依据。

云南特有火把梨UFGT基因片段的克隆与序列分析

为研究UFGT基因对红皮梨花色素苷合成的调控机制,以云南特有火把梨为试材,克隆得到UFGT的基因片段,运用生物信息学分析软件对该基因序列进行分析。结果表明:UFGT基因片段长1 440 bp,编码479个氨基酸的蛋白质;该氨基酸序列与沙梨、西洋梨、白梨、苹果和樱桃李的同源性分别为99%、96%、94%、91%和72%;蛋白无跨膜结构,不存在导肽和信号肽,属于非分泌蛋白,定位在胞液;结构功能域分析显示该片段含典型的GT1_Gtf_Like功能域和1个GTB型超家族蛋白的典型结构。

香蕉MaUFGT1基因克隆及表达分析

从香蕉果肉中克隆得到了一个类黄酮-3-O-葡糖基转移酶基因UFGT1基因全长,利用生物信息学方法分析了该基因的基本理化性质、蛋白二级结构、亚细胞定位、亲疏水性、信号肽、跨膜区、磷酸化位点、基因结构、保守结构域、系统进化关系,并对该基因的时空表达模式及香蕉果实不同发育阶段进行了表达分析。结果表明：UFGT1基因长1 380bp,编码459个氨基酸的蛋白质,该蛋白为疏水性蛋白,亚细胞定位在叶绿体,蛋白无跨膜结构,不存在信号肽;MaUFGT1在不同组织中均有表达,但表达丰度存在差异;MaUFGT1在巴西蕉和香粉1号蕉中,随着果实成熟,表达量逐渐上升,后期香粉1号明显高于巴西蕉。说明MaUFGT1可能参与了香蕉果肉黄酮类物质的合成。

苹果梨果实着色相关酶基因片段克隆及表达分析

通过RT-PCR技术对苹果梨果实着色相关酶(PAL、CHI、UFGT)基因片段进行了克隆,并且采用半定量RT-PCR技术进行了3种酶基因在不同发育阶段的表达分析。结果表明:苹果梨与其他植物PAL、CHI、UFGT的相同氨基酸和相似氨基酸的百分比都约为90%,分别与鸭梨、砂梨、西洋梨氨基酸序列聚类关系最近;套袋抑制PAL、CHI、UFGT 3种酶基因的表达,去袋后,3种酶基因的表达量明显增加。

欧李ChUFGT基因的克隆、生物信息学分析及亚细胞定位

为从分子水平上揭示欧李中3-O-类黄酮葡萄糖基转移酶(UFGT)基因的空间表达情况,以欧李叶片为试材,根据欧李的转录组序列设计特异性引物,通过PCR获得ChUFGT基因序列,并进行生物信息学分析及亚细胞定位分析。结果表明,ChUFGT基因DNA开放阅读框为1425 bp(不含终止子),相对分子质量为51.63 kD,编码475个氨基酸,其对应的蛋白质是带正电荷的稳定疏水性蛋白。与近缘物种的蛋白质序列比对分析显示,欧李、李和樱桃李的UFGT氨基酸序列相似度达到97.22%和96.62%,整个系统发育树存在两个大分支,其中ChUFGT与同科植物的亲缘关系最近,其次是与白梨、西洋梨、荔枝等其他科植物相对较近,与葡萄、刺葡萄、石榴等植物的亲缘关系最远。ChUFGT的亚细胞定位结果分析显示,在洋葱内表皮细胞的细胞核和细胞质中都表达该基因。本研究结果为进一步阐明ChUFGT调控欧李细胞花色素苷的合成机制提供了理论基础。

桑树类黄酮3–O–葡萄糖基转移酶基因的鉴定及主效基因功能分析

根据同源比对,从川桑(Morus notabilis)基因组数据库(morus.swu.edu.cn/morusdb/)中鉴定类黄酮3–O–葡萄糖基转移酶基因(MaUFGT)家族成员。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析MaUFGT在桑树各组织和发育期的表达水平。随着果实发育成熟,MaUFGT1、MaUFGT2和MaUFGT3的表达模式相似,均呈上升趋势;在从顶芽依次向下不同叶位中,3个UFGT基因表达呈现先降低后升高,再降低又升高的趋势;在幼茎皮层和托叶中大量表达,幼茎表皮和木质部、叶柄中表达量较低,有的甚至不表达。MaUFGT2的表达量在3个基因中都是最高的,推测其是该基因家族的主效基因。从桑树品种‘嘉陵40’成熟果实中克隆了UFGT2基因,命名为MaUFGT2,登录号KP455729.1。其c DNA全长为1 386 bp,编码461个氨基酸,推测蛋白质分子量约为51 k D。序列比对结果发现所编码蛋白在不同物种间保守性不高。将MaUFGT2克隆到p ET-28a(+)原核表达载体后在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析显示,融合蛋白大小约为55 k D,主要以包涵体形式表达,在上清液中也有少量表达。MaUFGT2蛋白经纯化和复性后,最后通过高效液相色谱(HPLC)分析该蛋白的酶活性,结果表明,体外酶活性鉴定MaUFGT2能够催化UDP葡萄糖转移至槲皮素形成槲皮素3–β–D–葡萄糖苷,验证了其具有糖基转移酶的功能。

艾纳香葡萄糖基转移酶基因的克隆与生物信息学分析

艾纳香(Blumea balsamifera)作为贵州道地药材,其次生代谢产物,如类黄酮、艾纳香素等具有重要的药理作用。葡萄糖基转移酶(UFGT)是艾纳香类黄酮代谢途径中的一个关键酶。本研究通过对艾纳香转录组进行测序,借助引物PCR成功克隆得到其葡萄糖基转移酶基因的cDNA序列,并对其进行了相应的生物信息学分析。分析发现,艾纳香UFGT基因cDNA全长1 527 bp,共编码508个氨基酸,所编码蛋白的分子量为56.155 k D,等电点为5.30,属于疏水性蛋白,可能定位于微体中。此外,艾纳香UFGT蛋白的二级结构中α螺旋占33.07%,延伸链占10.83%,无规则卷曲56.10%,与三级结构预测结果一致。本研究对于探究黔产艾纳香类黄酮物质的生物合成分子机制有一定的指导意义,并为将来类黄酮的生物合成提供帮助。