人巨细胞病毒UL145基因在先天感染患儿临床株中的多态性研究

目的:研究人巨细胞病毒(HCMV)UL145序列在先天感染患儿临床株中的基因多态性,探讨HCMV基因多态性与先天感染引起的不同临床症状之间的关系。方法:对16株临床低传代分离株和15株未传代临床株的HCMV临床标本分别进行UL145全序列PCR扩增,对PCR扩增阳性的31例标本进行序列测定及分析,并且与9株已在GenBank递交的HCMV UL145序列进行比较分析。结果:序列分析结果表明31株HCMV临床株的UL145基因是高度保守的。所有临床株的HCMV UL145开放阅读框架均为393 bp,编码蛋白含有130个氨基酸。所有临床株的核苷酸同源率为95.9%～100%,编码蛋白的同源率为97.7%～100%。临床症状不同的患儿其HCMV UL145基因及其编码蛋白具有相似的结构。所有先天感染患儿临床株的UL145编码蛋白具有蛋白激酶(C PKC)磷酸化功能位点和酪蛋白激酶(CK2)磷酸化功能位点。结论:HCMV UL145基因在临床株中是高度保守,未发现其与HCMV先天感染不同临床症状间存在明显的关系。HCMV UL145基因的高度保守性在先天感染中具有重要作用。

人巨细胞病毒UL145相互作用蛋白的筛选和功能分析

目的应用酵母双杂交系统筛选与人巨细胞病毒(HCMV)UL145编码蛋白相互作用的来源于人胎脑cDNA文库的组织蛋白。方法采用聚合酶链式反应扩增HCMV UL145片段,酶切及纯化扩增的目的片段及酵母表达载体p GBKT7,连接HCMV UL145片段及载体p GBKT7,将连接后的重组诱饵表达载体p GBKT7-UL145转化到酵母菌AH109中,再将人胎脑文库DNA也转化到酵母AH109中,筛选与HCMV UL145编码蛋白相互作用的蛋白,并对阳性克隆进行测序和生物信息学分析。结果最终确认多个克隆与HCMV UL145编码蛋白相互作用,BLAST结果显示3个与FOXG1高度同源。结论利用酵母双杂交系统成功筛选出与HCMV UL145编码蛋白相互作用的人胎脑c DNA文库蛋白FOXG1,推测该目的蛋白在HCMV感染所致神经系统损伤过程中起重要作用。

多参数预测人巨细胞病毒临床病毒株UL145基因B细胞表位

目的应用多参数预测及分析人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)临床病毒株UL145基因B细胞表位。方法根据人巨细胞病毒UL145基因氨基酸序列预测其二级结构,结合跨膜结构、亲水性、可及性及抗原性方案等参数综合预测UL145基因B细胞表位。结果HCMV pUL145氨基酸等电点为6.64,二级结构以无规则卷为主,1~130位氨基酸均为膜外区域,结合多种预测方法分析提示,88~99位氨基酸序列内可作为HCMV UL145基因的B细胞候选表位。结论多参数预测提示88~99位氨基酸序列为HCMV UL145基因B细胞表位预测序列,为进一步制备相应的抗体提供了重要依据。

广州地区先天性感染婴儿人巨细胞病毒UL145基因多态性研究

目的:研究广州地区先天性感染患儿体内巨细胞病毒(HCMV)临床低传代分离株UL145基因序列的特异性和多态性。方法:从广州地区先天性HCMV感染患儿体内分离HCMV临床病毒株。应用多重PCR方法鉴定HCMV后,对UL145基因扩增、克隆、鉴定及测序;应用生物信息学技术对临床HCMV病毒株的UL145基因进行序列分析,并分析UL145编码蛋白的理化性质及翻译后修饰位点。结果:成功地从先天性患儿体内分离出2株HCMV低传代病毒株(D2、D3),经鉴定后的UL145基因序列被GenBank收录,序列号为:DQ180367,DQ180381。分析显示,UL145的DNA和氨基酸序列的变异率分别是0.7%～1.5%和0.7%～2.2%;其编码蛋白等电点为6.35～6.64;该基因存在1个PKC磷酸化位点和2个CKⅡ磷酸化位点。结论:来自广州感染婴儿的HCMVUL145基因及其编码的氨基酸序列极为保守,但仍具有一定的多态性,这在HCMV临床感染与致病机制研究中具有重要意义。

靶向人巨细胞病毒UL145基因的CRISPR/Cas9基因敲除质粒的构建

目的构建靶向人巨细胞病毒UL145基因的CRISPR/Cas9基因敲除质粒。方法根据CRISPR/Cas9设计原则,设计3条靶向UL145基因的gRNA,构建重组lenti CRISPR-UL145-T1、T2、T3表达质粒,转化并挑选阳性克隆,进行PCR及测序验证。同时通过荧光素酶SSA(Luciferase SSA)检测CRISPR/Cas9活性,筛选出载体活性最佳质粒。结果设计了3条靶向gRNA并构建lenti CRISPR-UL145-T1、T2、T3表达质粒,经PCR及测序鉴定载体构建成功;通过Luciferase SSA检测,结果显示,lenti CRISPR-UL145-T3载体活性最强,明显高于lenti CRISPR-UL145-T1、T2载体活性。结论重组质粒lenti CRISPR-UL145-T3筛选为活性最佳质粒,为进一步进行体内外敲除人巨细胞病毒UL145基因及其功能奠定基础。