人巨细胞病毒UL148基因在临床低传代分离株中的多态性研究

目的 研究人巨细胞病毒 (HCMV)UL14 8序列在临床低传代分离株中的多态性。方法 对 38株经荧光定量PCR方法 (Q PCR)检测HCMV DNA为阳性的临床低传代分离株的细胞培养上清液进行HCMVUL14 8全序列PCR扩增 ,并对PCR扩增产物进行序列测定及分析。结果 38株临床低传代分离株有 17株PCR扩增阳性 ,与HCMVToledo株进行序列比较分析 ,17株临床分离株UL14 8开放阅读框架 (ORF)长度均与Toledo株相同。其编码蛋白的氨基酸变异率为 0 3%～ 2 3%。所有分离株均有蛋白翻译后修饰位点的新增或缺失。与Toledo株相比 17株临床分离株UL14 8蛋白质二级结构预测结果均为第 15～ 18位之间由α 螺旋变为 β 折叠。 结论 17株HCMV临床低传代分离株UL14 8基因及其编码产物的氨基酸序列比较保守 ,但仍存在一定程度的多态性。

人巨细胞病毒临床病毒株UL148基因的体外表达及功能位点预测

目的 体外获得人巨细胞病毒（human cytomegalovirus, HCMV）临床病毒株 UL148 RNA及探讨其基因功能.方法 将感染HCMV的新生儿尿液接种人胚肺细胞,分离HCMV临床病毒株,并经多重PCR鉴定.扩增UL148基因,经双酶切后克隆入pGEM-T-Easy质粒,构建重组质粒,并置于T7启动子下游,经重组质粒、PCR产物、双酶切产物电泳鉴定及序列测定.克隆成功的质粒以32P标记,进行体外转录RNA.根据UL148序列特征应用生物信息学分析其翻译后修饰位点.结果 成功在体外获得HCMV临床病毒株,经电泳及序列测定证实重组质粒构建成功,在T7 RNA聚合酶作用下,体外获得UL148 RNA.翻译后修饰位点显示UL148基因存在1个与细胞黏附相关的特征序列,1个豆荚外源凝集素β-链标记位点、2个N-豆蔻酰化位点,1个酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点,7个蛋白激酶C磷酸化位点,1个cAMP/cGMP-依赖性蛋白激酶磷酸化位点和2个N-糖基化位点,1个跨膜区域.结论 UL148基因编码产物可能为一个病毒黏附分子,参与宿主细胞的信号转导作用.

人巨细胞病毒临床病毒株UL148基因B细胞表位的预测与分析

目的预测与分析人巨细胞病毒(HCMV)临床病毒株UL148基因B细胞表位。方法应用生物信息学方法,以HCMV UL148基因氨基酸序列为基础,采用改进型自我优化预测结构(SOPMA),Garnier-Osguthorpe-Robson(GOR),人工神经网络预测法(HNN)预测二级结构,结合跨膜结构、Hopp&Woods亲水性方案、Emini可及性方案、Jameson-Wolf抗原性方案等参数综合预测UL148基因B细胞表位。结果 HCMV pUL148氨基酸包含316个氨基酸残基,相对分子质量为36kD,等电点为9.15;应用SOPMA,GOR,HNN方案预测pUL148二级结构,均显示以α-螺旋为主,无规则卷及β-转角区域多位于14～21,98～106,132～139,174～181,191～197,267～272,235～240。TMHMM预测pUL148存在一个跨膜区域,为286～308位氨基酸,胞外区域为1～285位氨基酸。结论 HCMV UL148基因265～275,221～229,18～25位氨基酸序列区域内或其附近主要以无规则卷或β-转角结构为主,且抗原指数(AI)较高,极有可能是B细胞表位。

人巨细胞病毒临床分离株的鉴定及UL148基因分析

目的:研究广州地区先天性感染患儿体内人巨细胞病毒(HCMV)临床低传代分离株的鉴定及其UL148基因的序列特征分析。方法:收集广州地区感染HCMV的新生儿尿液标本,从中分离低传代临床病毒株,应用多重PCR方法鉴定,对其进行UL148基因全序列扩增,扩增产物克隆到pMD18-T载体后进行序列测定及分析。结果:成功分离出3株HCMV低传代病毒株(D2、D3、D52),经鉴定后的UL148基因序列被GenBank收录,序列号为:DQ180380,DQ180363和DQ180354。序列分析显示,3株临床分离株中UL148序列高度保守;在UL148全基因序列951个核苷酸中,所有变异均为碱基替换,无插入及缺失突变;编码蛋白由316个氨基酸残基组成,氨基酸序列也比较保守,各分离株中变异率为0.3%～1.9%;编码蛋白翻译后修饰位点包括细胞黏附相关的特征序列、PKC磷酸化位点、酪氨酸激酶II磷酸化位点、cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点等;其编码蛋白等电点为9.17～9.37。结论:广州地区HCMV UL148基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列极为保守,但仍具有一定的多态性,提示UL148 ORF可能是一个重要的功能基因。

人巨细胞病毒UL148A、UL148B、UL148C、UL148D基因在临床株中的多态性研究

目的研究人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)UL148A、UL148B、UL148C和UL148D基因序列在临床低传代分离株中的多态性。方法对22株经荧光定量PCR方法(Q-PCR)检测HCMV-DNA为阳性的临床株进行HCMV UL148A、UL148B、UL148C和UL148D基因全序列PCR扩增,并对PCR扩增产物进行序列测定及分析。结果22株临床株序列与Merlin株相比.临床分离株UL148A基因的核苷酸变异率为0.5%～8.3%,氨基酸变异率为1.3%～6.3%;UL148B基因核苷酸变异率为0.5%～4.6%,氨基酸变异率为1.3%～5.0%;UL148C基因核苷酸变异率为0.5%～3.0%,氨基酸变异率为1.3%～3.9%;UL148D基因核苷酸变异率为0.6%～8.5%,氨基酸变异率为1.7%～8.1%。22株HCMV UL148A和UL148D序列均分为3个型。与Merlin株比较,除U96株外,来自未经传代的尿标本中的UL148A、UL148B、UL148C和UL148D基因编码产物含有的翻译后修饰位点均保守。结论UL148C基因无论在核苷酸序列还是在蛋白的氨基酸结构上均较为保守。统计学分析显示HCMV UL148A和UL148D基因呈现一定的相关性。

应用外部引导序列切割人巨细胞病毒UL148 RNA的研究

目的 研究人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus,HCMV）临床病毒株UL/b＆#39;区域UL148基因功能及抗HCMV治疗新策略,应用DNA性质外部引导序列（External guide sequences,EGS）在体外抑制UL148 RNA的表达.方法 应用RNA structure生物软件模拟UL148 RNA二级结构,选择二级结构相对简单的区域设计EGS,并合成EGS核苷酸序列.应用PCR方法分别扩增UL148及M1RNA基因,克隆至T7启动子下游,在T7 RNA聚合酶的作用下,体外转录UL148 RNA及M1RNA,其中UL148以32p标记并进行体外转录.混合EGS、M1RNA及UL148 RNA于切割反应液中,反应1h后,进行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,Typhoon扫描仪观察结果.结果 根据UL148 RNA二级结构选取第58 ～72位碱基作为EGS结合区域,其切割位点位于57位,针对此区域设计EGS57,并在体外进行EGS57与UL148 RNA结合的二级结构的模拟,可形成M1RNA天然作用底物类似的茎环结构.在T7 RNA聚合酶的作用下,分别在体外转录M1RNA及UL148 RNA,其大小均与预期相符.经切割反应,可获得与预期切割位点相符的切割条带.结论 EGS57可切割UL148RNA,其切割位点准确,与预期相符.该研究为进一步探讨UL148基因功能提供有效基因沉默工具.