HCMV截短UL83基因真核表达重组体的构建、转染及其免疫效力研究

为了构建人巨细胞病毒（HCMV）截短UL83基因真核表达重组体，实现其在Hep-2细胞中的稳定表达，研究该截短UL83基因真核表达重组体免疫效力，采用基因重组的方法，将HCMVAD169株截短UL83基因定向克隆到带有绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因的真核表达载体pEGFP-C1上，构建真核重组表达质粒pEGFP-C1-UL83；脂质体转染至Hep-2细胞中，G418筛选获得稳定表达pp65细胞表达系。经基因测序屁示，重组体中截短UL83基因完全正确。RT-PCR和Westem blot检测证实其可在Hep-2细胞中稳定表达。用该重组体和其表达产物在HCMV先天性感染小鼠模型上进行免疫保护试验显示，母鼠血清可检测到特异性抗HCMVpp65抗体，效价为：1：2．51～1：50．79；子鼠脑组织内未分离出病毒，亦未检测出病毒pp65蛋白抗原表达。初步结果表明，pEGFP-C1-UL83具有较好的免疫原性，可作为DNA疫苗刺激机体产生有效抗体。并具有阻止病毒垂直传播的保护性作用。

抑制人巨细胞病毒UL83基因对人脑动脉平滑肌22α及血管紧张素受体表达的影响

目的探讨人巨细胞病毒UL83基因对人脑动脉平滑肌22α及血管紧张素受体表达的影响。方法利用转染技术把RNA干扰转染到人巨细胞病毒感染的体外培养的人脑动脉血管平滑肌细胞中,建立RNA干扰人巨细胞病毒UL83基因的细胞模型。采用免疫荧光技术、逆转录聚合酶链反应和蛋白电泳等技术观察平滑肌22α及血管紧张素1型受体和2型受体基因的表达变化。结果利用RNA干扰技术成功干扰了人巨细胞病毒UL83基因mRNA的复制和蛋白表达,沉默人巨细胞病毒UL83基因后血管紧张素1型受体基因表达下调,而血管紧张素2型受体基因和平滑肌22α基因表达上调。结论成功建立了人巨细胞病毒感染体外培养的人脑动脉血管平滑肌细胞UL83基因沉默的细胞模型。人巨细胞病毒UL83基因可能通过激活血管紧张素1型受体,抑制血管紧张素2型受体和平滑肌22αmRNA的转录表达来发挥作用。

干扰长单一序列区83基因对人巨细胞病毒感染后人脑血管平滑肌促血管生成素及血管内皮生长因子表达的影响

目的长单一序列区(unique long region 83,UL83)基因是人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染再激活标志。本研究拟探索UL83对HCMV感染后人脑血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)中不稳定斑块破裂相关因子,如促血管生成素(angiopoietin,Ang)以及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的影响。方法 (1)采用流式细胞仪确定amidite荧光素(fluorescein amidite,FAM)标记的小干扰核糖核酸(small interfering ribonucleic acid,si RNA)通过脂质体转入人脑VSMC的转染效率;(2)将3条化学合成si RNA通过脂质体转染入已感染HCMV AD_(169)株(MOI=10)的人脑VSMC当中,结合空白组、接毒组及接毒无效干扰组筛选抑制UL83基因最强si RNA;(3)分别检测HCMV AD_(169)株(MOI=10)感染人脑VSMC后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h以及72 h Ang-1、Ang-2及VEGF-A信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,m RNA)及蛋白表达变化;(4)分别检测空白组、接毒高效干扰组、接毒无效干扰组及接毒组在感染48 h后Ang-1、Ang-2及VEGF-A的mRNA及感染72 h后上述蛋白表达情况。结果转染6 h后,95.59%人脑VSMC转染了FAM标记si RNA。感染HCMV AD_(169)株(MOI=10)的人脑VSMC在转染siRNA 48 h后,si RNA转染组与接毒组相比,UL83 m RNA相对表达量最多下降78.7%;转染si RNA72 h后,UL83编码的pp65蛋白相对表达量最多下降81.3%。人脑VSMC感染HCMV AD_(169)株(MOI=10)0 h、6 h、12 h、24 h、48 h以及72 h时后,Ang-1 m RNA及蛋白相对表达量逐渐下降(P<0.01),Ang-2及VEGF-A mRNA及蛋白相对表达量则逐渐增加(P<0.01)。而通过转染高效si RNA抑制HCMV AD_(169)株UL83基因,使得Ang-1表达下降,Ang-2和VEGF-A表达增加均被抑制。结论 HCMV AD_(169)株具有同时促进人脑VSMC中Ang-1表达降低,Ang-2及VEGF-A表达增加功能。而通过si RNA抑制HCMV AD_(169)株UL83基因表达能够阻止上述变化。提示HCMV可能通过UL83基因造成靶细胞产生促血管新生微环境。