伪狂犬病病毒US3基因编码丝/苏氨酸蛋白激酶功能的研究进展

伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)属于甲型疱疹病毒亚科水痘病毒属,其基因组约为150 kb,可分为独特长区、内部重复序列、独特短区以及末端重复序列。PRV US3基因位于其基因组的独特短区,属于复制非必须基因,是病毒的重要毒力基因,编码产物是丝/苏氨酸激酶。US3基因编码蛋白是一种多功能蛋白,可参与PRV逃避宿主免疫清除,抑制病毒介导的细胞凋亡,影响病毒粒子在细胞核质中的运输,调动感染细胞肌动蛋白骨架重排,诱导宿主细胞形态改变进而增强PRV在细胞中的传播能力,在病毒生命周期的多个阶段发挥作用。本文综述了PRV US3编码蛋白功能的研究进展,为PRV致病机制的研究提供了参考。

宿主膜联蛋白A2与伪狂犬病病毒US3蛋白互作及其对细胞凋亡的影响

US3蛋白激酶是伪狂犬病病毒(PRV)的一个重要毒力因子,研究显示US3参与了细胞骨架重排、病毒复制和传播、细胞凋亡和干扰素信号通路等多个生物学过程,鉴定新的和US3互作的宿主蛋白对于认识其生物学功能具有重要意义。本研究首先利用免疫共沉淀和pull-down技术验证了US3和宿主膜联蛋白A2(ANXA2)的相互作用;然后利用RNAi技术,通过荧光定量PCR、病毒滴度测定和免疫印迹分析,发现敲低ANXA2的表达显著抑制了PRV在PK-15细胞上的增殖;进一步发现过表达ANXA2可以抑制PRV或者凋亡刺激剂诱导的细胞凋亡,提示ANXA2具有负调控细胞凋亡的作用。本研究进一步完善了可以和US3蛋白互作的宿主蛋白成员,加深了人们对ANXA2生物学功能的理解。

表达US3基因腺病毒载体下调CTL和NK细胞对其转染肝细胞杀伤活性的影响

目的研究表达US3基因重组腺病毒载体对其转染肝细胞介导的免疫逃逸活性。方法首先构建表达US3基因腺病毒载体,扩增纯化后转染HL-7702肝细胞,利用细胞毒性T细胞(CTL)杀伤实验和自然杀伤细胞(NK)杀伤实验,检测表达US3基因重组腺病毒载体的免疫活性。结果表达US3基因的重组腺病毒r-US3成功构建,r-US3能够明显降低CTL和NK细胞对转染肝细胞的杀伤活性。结论表达US3基因腺病毒载体在一定程度上能够介导转染肝细胞的免疫逃逸,降低机体免疫系统对转染肝细胞的排斥反应。

单纯疱疹病毒Us3基因功能的研究进展

单纯疱疹病毒Us3基因编码为一个丝/苏蛋白激酶,作为一个附加基因,其产物Us3蛋白激酶(Us3PK)与介导病毒抗宿主细胞凋亡关系密切。Us3基因诱导的宿主细胞形态学变化与病毒在细胞间的传播能力密切相关,此为Us3基因的一个新功能,作者对此作一综述。

US3基因转染树突状细胞诱导的T淋巴细胞增殖活性及NK细胞杀伤活性观察

目的观察US3基因转染树突状细胞(DCs)诱导的T淋巴细胞增殖活性和自然杀伤(NK)细胞杀伤活性。方法构建表达US3基因腺病毒载体r-US3和空载体r-Track。分离培养DCs,分为r-US3组(转染r-US3的DCs细胞)、r-Track组(转染r-Track的DCs细胞)和正常对照组,将三组细胞分别与T淋巴细胞混合培养,MTT法观察各组DCs诱导的T淋巴细胞增殖活性;另外将三组细胞分别与NK细胞混合培养,乳酸脱氢酶释放法观察NK细胞杀伤活性。结果 r-US3组、r-Track组、正常对照组混合培养第24 h时T淋巴细胞增殖活性分别为1.250 0±0.062 4、1.653 3±0.035 1、1.596 7±0.066 6,混合培养第48 h时分别为1.823 3±0.066 6、2.203 3±0.047 3、2.136 7±0.060 3,r-US3组与r-Track组、正常对照组相比,P均<0.05。r-US3组、r-Track组、正常对照组NK细胞杀伤DCs活性分别为87.67%±3.21%、103.02%±2.65%、100.00%,r-US3组与r-Track组、正常对照组相比,P均<0.05。结论转染US3基因的DCs诱导的T淋巴细胞增殖和NK细胞杀伤活性降低。

表达US3腺病毒载体对混合淋巴细胞和NK细胞反应中γ干扰素和穿孔素表达的影响

目的探讨表达US3基因的重组腺病毒载体介导其转染供体外周血单个核细胞(PBMCs)的免疫逃逸活性。方法首先构建表达US3基因的腺病毒载体,扩增纯化后转染供体PBMCs,利用混合淋巴细胞和NK细胞反应,通过检测反应中γ干扰素和穿孔素的表达量,观察表达US3基因重组腺病毒载体的免疫活性。结果表达US3基因重组腺病毒载体r-US3能够明显降低混合淋巴细胞和NK细胞反应中细胞因子γ干扰素和穿孔素的产量,抑制混合淋巴细胞和NK细胞反应活性。结论表达US3基因腺病毒载体在一定程度上能够介导其转染供体PBMCs的免疫逃逸,降低机体免疫系统对其转染细胞的排斥反应。

US3仿真系统的网络通信系统的设计与实现

针对US3仿真系统的特殊功能和要求,网络系统设计采用了二层的星型以太网物理拓扑结构,并依据US3系统内程序开发的固定结构和模式,开发设计实时、可靠的网络通信软件,最后有针对性的分析了关键技术。

基于US3仿真支撑平台的通信程序设计

介绍基于US3仿真支撑平台数据通信程序的系统分析和程序设计。该通信程序采用C语言设计,依据训练系统实时性和低耦合的设计要求,对各个单元进行了模块化开发,并针对仿真系统自身特点提出软件设计中的关键技术。

猫疱疹病毒Ⅰ型US3基因剪接异构体的鉴定

为鉴定猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)US3基因的编码产物,本研究以提取FHV-1感染细胞的总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增US3基因转录产物,测序结果显示除了全长US3基因(1 056 bp)外,还出现了一个825 bp的片段(US3-X1)。该片段是由全长US3基因在226 bp^458 bp位置发生了自我剪接,导致234 bp DNA缺失而产生,但ORF并没有改变。此外,通过重叠延伸PCR将US3基因226 bp处碱基"A"突变为"G"(m US3),改变自我剪接位点。将全长US3基因、m US3和US3-X1基因分别克隆至p3×Flag-CMV-10中,转染F81细胞,经western blot检测表明FHV-1 US3可以表达两种不同分子量的异构蛋白,大小约为45 ku和50 ku。这种US3基因的剪接异构体现象在猪伪狂犬病毒和人单纯疱疹病毒中已有报道,而FHV-1 US3基因的剪接异构体的鉴定尚属首次。该研究结果为进一步研究FHV-1 US3异构体蛋白的功能奠定了基础。

HSV Us3蛋白激酶对巨噬细胞生物学活性和凋亡的影响研究

为探讨单纯疱疹病毒Us3基因及其编码产物对LPS活化的巨噬细胞生物学活性和凋亡的影响,小鼠巨噬细胞系RAW246.7细胞瞬时转染pcDNA3.1(+)-Us3重组质粒并体外培养。利用免疫荧光技术检测转染率,ELISA方法检测培养上清中TNF-α分泌水平,Annexin-V染色评价转染细胞凋亡情况。结果发现,pcDNA3.1(+)-Us3重组质粒可成功转染至RAW246.7细胞,转染率为10.3%。与空质粒转染组相比,pcDNA3.1(+)-Us3转染细胞培养上清中TNF-α分泌水平明显升高,但凋亡细胞数量略有下降,证实Us3基因及其编码蛋白在调控巨噬细胞细胞因子分泌活性及其活化细胞凋亡方面发挥一定作用。

us3基因的缺失对单纯疱疹病毒1型毒力和抗凋亡功能的影响

利用CRISPR/Cas9系统使单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1) ul7、ul41、LAT 基因缺失构建M3减毒株(M3株),在M3株基础上通过缺失 us3 得到M4突变株(M4株)。本研究旨在分析野毒株(McKrae株)、M3株与M4株在毒力和抗细胞凋亡方面的差异。结果表明,McKrae组出现明显的临床症状,且100%死亡(P<0.001),而M3、M4组未出现临床症状。M4组小鼠组织中病毒载量明显低于McKrae组和M3组;病理学检测表明,McKrae组出现蛛网膜出血、胶质小结等现象,而M3、M4组未见病理损伤,M4组炎性因子表达与McKrae、M3组相比也显著下降(P<0.01);免疫后M4组较M3组出现高水平的中和抗体、γ干扰素(interferon γ,IFN-γ)和白细胞介素4(interleukin 4,IL-4)抗原特异性T细胞;McKrae株再次感染时,M4组小鼠组织中病毒载量明显低于对照组和M3组;在人急性T细胞淋巴瘤细胞中,M4株相比McKrae株和M3株可明显诱导细胞凋亡。

猫疱疹病毒Ⅰ型US3基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)US3蛋白的多克隆抗体,本研究通过PCR方法扩增US3基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-US3;然后转化大肠杆菌BL21(DE3),经1mmol/L IPTG诱导表达His-US3重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot试验表明,该重组蛋白为可溶性表达,并且具有较好的反应原性。将切胶纯化后的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价达1:10,000以上。Western blot和间接免疫荧光试验显示,多克隆抗体能够与US3蛋白特异性结合。US3多克隆抗体的制备为US3缺失株的检测及进一步研究US3蛋白的生物学功能奠定了基础。

US3基因检测在新生儿晚期黄疸巨细胞病毒感染诊断中的应用

目的探讨US3基因检测在新生儿晚期黄疸巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染诊断中的应用。方法应用巢式PCR法检测2012年1-12月在新生儿科就诊的新生儿晚期黄疸标本US3基因,并通过与HCMV-Ig M、HCMV-DNA荧光定量PCR、HCMV-pp65抗原检测结果做比较,分析US3基因检测在诊断新生儿晚期黄疸HCMV感染的符合程度。结果 1145例新生儿晚期黄疸血清HCMV-Ig M检测阳性1例,HCMV荧光定量PCR检测阳性24例,HCMV-pp65抗原阳性25例,US3基因扩增阳性24例;2US3基因检测与HCMV-DNA荧光定量PCR两种检测方法结果差异无统计学意义(P=1.000),一致率为97.2%,κ值为0.900;US3基因检测与HCMV-pp65抗原检测两种检测方法结果差异无统计学意义(P=1.000),一致率为95.2%,κ值为0.828;3US3基因检测用于诊断新生儿晚期黄疸HCMV感染的灵敏度为85.2%,特异度为99.2%,Youden指数为84.4;阳性预测值和阴性预测值分别为0.958和0.967;4US3基因检测用于诊断新生儿晚期黄疸HCMV活动性感染的灵敏度为84.0%,特异度为97.5%,Youden指数为81.5;阳性预测值和阴性预测值分别为0.875和0.967。结论 US3基因检测适用于临床新生儿晚期黄疸HCMV感染的诊断。

人巨细胞病毒临床株US3基因HLA-A*0201限制性CTL表位预测

目的分析晚期黄疸新生儿人巨细胞病毒(HCMV)感染患儿临床株US3基因序列,预测HCMV US3基因HLA-A*0201限制性CTL表位。方法应用巢式PCR法检测20例HCMV感染新生儿标本US3基因,结果进行双向DNA测序。SYFPEITHI和NetCTL方案预测HCMV临床株US3基因HLA-A*0201限制性CTL表位。结果①以Towne作为参考株,序列比对分析显示,20株临床分离株US3的ORF长度均与参考株相同,为561 bp,编码186个氨基酸蛋白。US3氨基酸序列高度保守,仅几个位点在少数分离株中存在变异,变异主要集中在序列的N端,大部分是同义突变。②通过预测获得5个HCMV US3基因HLA-A*0201限制性CTL表位:FTEKHFVSV、RMDYSSQTI、RMDYSSHTI、SIRDDNWGL和SMRDDNWGL。不同临床株US3基因HLA-A*0201限制性CTL表位存在差异。结论初步筛选出人巨细胞病毒临床株US3基因HLA-A*0201限制性CTL表位,为进一步研究HCMV感染的免疫机制提供实验依据。

晚期黄疸新生儿人巨细胞病毒感染与US3基因多态性的关系

目的了解晚期黄疸新生儿人巨细胞病毒(HCMV)感染状况,探讨HCMV US3基因多态性与致病性之间的关系。方法应用巢式PCR法检测2010年1～6月在本院新生儿科就诊的79例晚期黄疸新生儿样本HCMV US3基因,阳性标本结果进行双向DNA测序,通过BioEdit、DNAstar、GeneDoc等软件进行序列分析。结果 79例晚期黄疸新生儿中20例HCMV US3基因PCR扩增阳性,阳性率25.3%。以Towne作为参考株,序列比对分析显示,20株临床分离株US3的ORF长度均与参考株相同,为561bp,编码186个氨基酸蛋白。US3核酸变异比较普遍,变异主要集中在序列的N端,大部分是同义突变,US3氨基酸序列高度保守,仅几个位点在少数分离株中存在变异。未发现US3基因多态性与临床致病性的联系。结论 HCMV感染是导致新生儿晚期黄疸的重要原因之一。20株临床分离株HCMV US3基因编码的氨基酸序列比较保守,但仍存在一定的多态性。未发现不同临床分离株US3基因多态性与HCMV引起的新生儿晚期黄疸的联系。

程序性细胞死亡因子4与单纯疱疹病毒US3蛋白相互作用及参与细胞凋亡

程序性细胞死亡因子-4(programmed cell death-4,PDCD4)通过阻断相关基因的转录与翻译从而抑制肿瘤发生,单纯疱疹病毒-1(herpes simplex virus-1,HSV-1)US3蛋白激酶可有效调控病毒基因产物或外源因素引致的细胞凋亡。近期研究证明PDCD4在病毒感染细胞中以US3依赖及非依赖两种模式被磷酸化修饰,其中受US3修饰的PDCD4仍定位细胞核并随之被降解,这可能是细胞凋亡被抑制的主要原因之一,此外,PDCD4沉默可阻断复制不完全病毒引致的细胞凋亡,表明PDCD4与HSV-1 US3阻断细胞凋亡途径直接相关。本文综述了这两种蛋白及其作用关系的研究进展,为解析病毒与细胞相互作用机理提供新方向。

伪狂犬病病毒变异株US3基因失活株的构建与生物学特性分析

为探究US3基因失活对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)变异株毒力的影响,运用En Passant操作技术,将PRV变异株AH02LA细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)BAC^PRV-G中US3基因的起始密码子进行点突变,获得重组BAC株BAC^PRV-G-US3mut。将BAC^PRV-G-US3mut与带有同源臂和PRV AH02LA gE/gI基因的片段共转染猪睾丸(ST)细胞,拯救病毒的同时将gE/gI基因进行恢复,获得重组病毒PRV-US3mut。生长动力学试验发现:PRV-US3mut在感染ST细胞早期(6 h和12 h)无病变发生,在感染24 h之后,与亲本毒株PRV AH02LA生长动力学相似,表明US3基因可能介导病毒增殖的早期阶段。此外,研究发现了US3基因抑制PRV感染ST细胞早期组织相容性复合物Ⅰ的mRNA转录。BALB/c小鼠的致病力试验发现,相较于亲本毒株PRV AH02LA(LD50=10-3.26/0.2mL),PRV-US3mut(稀释10-2~10-5)攻毒小鼠全部存活,表明US3基因可能介导PRV对小鼠的致病性。本研究成功构建了PRV变异株US3基因失活株,为研制针对PRV变异株的弱毒疫苗奠定了基础。

US3/US7/US8/UL23/UL50基因缺失重组伪狂犬病病毒的构建及对犬致病性分析

自2011年以来,伪狂犬病(PR)在我国猪群中暴发,为控制PR的传播,基于流行的变异株研制了US7/US8/UL23缺失重组伪狂犬病病毒(rPRV)疫苗。疫苗可以对猪提供有效的免疫保护,但由于食用被污染的生肉或免疫猪的内脏,毛皮动物如犬、狐狸、水貂等越来越多地受到PRV弱毒疫苗株的感染,该感染对于毛皮动物是致死性的。本研究以rPRV^(delUS7/US8/UL23)为基础,利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术构建rPRV^(delUS7/US8/UL23/US3/UL50);比较了rPRV^(delUS7/US8/UL23)(三缺失)和rPRV^(delUS7/US8/UL23/US3/UL50)(五缺失)的体外生长动力学和对犬致病性。结果显示,重组病毒rPRV^(delUS7/US8/UL23/US3/UL50)在感染后24~48 h的生长动力学低于rPRV^(delUS7/US8/UL23)。此外,rPRV^(delUS7/US8/UL23)感染细胞可产生细胞融合现象,而^(rPRVdel US7/US8/UL23/US3/UL50)感染细胞未形成细胞融合。US7/US8/UL23缺失rPRV攻毒的犬表现出明显的神经症状,所有犬均死亡,但用US7/US8/UL23/US3/UL50缺失rPRV攻毒的犬未表现出任何神经症状,所有犬在试验期间均存活。组织病毒载量分析并未显示出明显差异。本研究结果表明,US7/US8/UL23/US3/UL50缺失的rPRV对犬无致病力,同时也凸显了US3、UL50基因在PRV感染犬等毛皮动物呈现高毒力中的作用,为研发更安全的疫苗提供了策略。

PRV △gE/TK/US3基因缺失株的构建及对小鼠的免疫效力

为验证伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)US3基因缺失后作为疫苗的免疫效力,构建PRV△gE/TK/US3基因缺失株。利用PRV QYY2012变异株基因组扩增US3基因两侧序列作为同源重组的左右侧同源臂,以绿色荧光蛋白(EGFP)为标记基因,经酶切依次连接至pBluescript SK(-),构建重组转移载体pSK-US3-LR-EGFP。将pSK-US3-LR-EGFP和PRV△gE/TK株基因组共转染293 T细胞,以绿色荧光为标记经蚀斑纯化获得重组病毒PRV△gE/TK/US3/EGFP~+株。将pcGlobin2-Cre质粒和PRV△gE/TK/US3/EGFP~+株基因组共转染293 T细胞,利用Cre-Loxp系统去除EGFP基因,蚀斑纯化无荧光重组病毒,获得PRV△gE/TK/US3基因缺失株,并对该毒株遗传稳定性、生物学特性、安全性和免疫效力进行初步研究。PCR及测序鉴定证实PRV△gE/TK/US3株缺失US3基因925 bp,在Vero细胞可稳定传代;与PRV△gE/TK亲本株相比,PRV△gE/TK/US3株病毒滴度较低,但仍具有良好的增殖能力。该基因缺失毒株接种小鼠后具有安全性,能产生较PRV△gE/TK株更高水平的抗PRV中和抗体,且能维持较长时间;PRV△gE/TK/US3株免疫小鼠对PRV强毒株攻击可提供完全保护力。结果表明,成功构建的PRV△gE/TK/US3基因缺失株具有良好的免疫原性,可作为优秀的伪狂犬病基因缺失疫苗候选种毒株。

生殖器疱疹的研究和治疗进展

生殖器疱疹是一种常见的性传播疾病,容易反复发作,很难彻底治愈,给患者的生理和心理造成极大的困扰。目前对该病复发机制的研究较多,尤其是潜伏相关转录体(LAT)、Us3基因及Toll样受体。本文就近几年的研究和治疗进展做一综述。