通用模板PCR技术快速检测乙肝病毒YMDD变异株

目的 探讨快速、安全地检测血清中对拉米夫定耐药的乙型肝炎病毒YMDD变异株。方法 用UT- PCR法结合Taqman荧光探针技术 ,针对HBVcodon 5 5 0位设计两条高度特异性引物Pi和Pv ,并设置保守区对照引物Pc ,在HBV耐药检测中使用了 3管阵列 ,经在PE70 0 0上进行PCR后 ,根据△Cti和△Ctv值 ,来判断是否发生了YVDD和YIDD突变。结果 检测 163例经拉米夫定治疗的病人血清 ,5 1例YMDD变异株阳性 ,其中随机选 15例样本进行DNA测序 ,结果完全相符。结论 本方法具有快速、准确、安全等特点 ,值得推广。

3种检测乙型肝炎病毒YMDD变异方法比较及结果分析

目的对检测乙型肝炎病毒（HBV）YMDD变异的3种方法进行比较并分析结果。方法对101例用拉米夫定治疗的HBV感染者，测定其治疗前HBV DNA水平，定期随访，分别以通用模板信号扩增（UT-PCR）、限制性片段长度多态性分析（PCR—RFLP）和DNA测序法检测病毒YMDD变异。结果UT—PCR和PCR-RFLP的检测结果与DNA测序结果的符合率均为98．11％。按治疗前HBV DNA水平分为5×10^2～5×10^4拷贝／mL，5×10^4～5×10^6拷贝／mL，5×10^6～5×10^8拷贝／mL，〉5×10^8拷贝／mL4个组，YMDD变异率分别为10％，12．90％，32．43％和53．85％。YMDD突变后，HBV DNA水平显著降低，其中WDD突变株的HBV DNA水平高于YIDD突变株（P〈0．01）。结论UT-PCR法适合临床检测HBV YMDD变异。乙型肝炎患者用拉米夫定治疗时，病毒DNA水平越高，发生YMDD变异的几率越大。突变株的复制能力低于野生株，YVDD突变株复制能力强于YIDD突变株。

Detection of YMDD.mutants using universal template real-time PCR

AIM： To establish a rapid and accurate method for the detection of lamivudine-resistant mutations in hepatitis B virus and monitor of lamivudine resistance during lamivudine treatment in patients with chronic hepatitis B virus infection. METHODS： We established a real-time PCR method using a universal template and TaqMan probe to detect YMDD mutants. Variants of YVDD and YIDD were tested by individual reactions （reaction Ⅴ and reaction Ⅰ） and total hepatitis B viruses were detected in another reaction for control （reaction C）. Results were determined by △Ct〈3.5 （△Ct = Ct of reaction Ⅴ or Ⅰ - Ct of reaction C）. Clones of the HBV polymerase gene containing different YMDD mutations were tested. Serum samples from 163 lamivudine-treated patients with chronic hepatitis B virus infection were detected using this method and the results were confirmed by DNA sequencing. RESULTS： As many as 1000 copies per milliliter of widetype plasmid were detected and nonspecific priming was excluded. In the 163 samples from patients treated with lamivudine, lamivudine-resistant mutations were detected in 51 samples. CONCLUSION： This universal real-time PCR is a rapid and accurate method for quantification of YMDD mutants of HBV virus in lamivudine-treated patients and can be used to monitor lamivudine-resistant mutations before and during lamivudine therapy.

TaqMan MGB双探针法和通用模板PCR法检测慢性乙型肝炎病毒YMDD变异的比较

目的对检测HBV YMDD变异的TaqManMGB双探针法和通用模板PCR法做方法学比较,探讨其临床实用性。方法分别以TaqManMGB双探针和通用模板PCR法,对拉米夫定治疗过程中血清出现HBV DNA由阴转阳的87例慢性乙型肝炎患者,进行HBV YMDD变异检测,并以测序结果为标准,比较它们的灵敏度和特异性。结果TaqMan探针法和通用模板PCR法检测灵敏度分别为100%和93.02%,特异性均为100%,与测序法的符合率为98.9%和96.6%。两种方法学敏感度分别为5.0×105copies.L-1和1.0×106copies.L-1。结论TaqMan探针法检测HBV YMDD变异灵敏度高、特异性好,是临床检测HBVYMDD的较好方法。

通用模板信号扩增技术

CR是最常用的分子生物学诊断技术 ,但目前常用的PCR都存在种种不足 ,制约了其在临床的应用。我们在Taq man荧光PCR的基础上开发了通用模板信号扩增技术 (UT PCR)比较好的解决了传统PCR核酸模板质量容易引起的假阴性以及难以实现多基因 /多位点同时检测两大难题。UT PCR具有灵敏度高、特异性强、假阴性低 ,并能实现高通量检测 ,在临床诊断和科学研究中有广泛的应用空间。

乙型肝炎病毒YMDD变异不同检测方法比较与评价

目的比较检测乙型肝炎病毒(HBV)YMDD变异的3种不同方法,评价其在监测拉米夫定抗HBV治疗中发生耐药突变的价值。方法对80例接受拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者,测定其治疗前后血清HBVDNA含量、ALT水平变化,分别用聚合酶链反应微板核酸杂交-酶联免疫吸附法(PCR-ELISA)、通用模板信号扩增(UT-PCR)技术、以及基因测序3种方法进行HBVYMDD变异检测,并分析结果。结果80例患者用基因测序法检测出34例发生YMDD变异,变异发生率为41.25%;用PCR-ELISA法检测出21例变异阳性,与基因测序检测出的阳性率差异有显著性(χ2=4.68,P<0.05),两者结果的符合率为61.76%;用UT-PCR法检测出33例变异阳性,与基因测序检测出的阳性率无统计学差异(χ2=0.03,P>0.05),两者结果的符合率为97.06%。结论基因测序和UT-PCR方法检测HBVYMDD变异非常可靠,是监测拉米夫定耐药株的非常有效的方法,UT-PCR方法更适合临床应用,而PCR-ELISA方法需提高其敏感性。

PCR产物末端性质的分析研究

利用PCR、UT PCR、克隆及测序等技术 ,对强直性肌营养不良基因 (MT PK) 3′ 非翻译区分别用Taq ,Taq +PwoDNA聚合酶进行了扩增、克隆和测序 ,研究了PCR产物末端组成情况 ,并比较了上述两种DNA聚合酶对PCR产物末端的影响 .结果在用TaqDNA聚合酶扩增的PCR产物主要得到 3′端突出 1个A (占 6 7 3% ,35 /5 2 ) ;在Taq +PwoDNA聚合酶扩增的PCR产物末端中得到 3′端 +A的仅占 17 4% ,而 - 1的占 34 8% ,与前者显著不同 .