Biochemical Characterization of Uracil-DNA Glycosylase from Pyrococcus furiosus

We report the characterization of a uracil-DNA glycosylase（UDG） from the hyperthermophilic archaea Pyrococcus furiosus（P, furiosus）. P. furiosus UDG（PfUDG） has high sequence similarity to the families IV and V UDGs（thermostable UDG family and PaUDG-b family）. PfUDG excises uracil from various DNA substrates with the following order： U/T=U/C〉U/G=U/AP=U/-〉U/U=U/I=U/A. The optimal temperature and pH value for uracil exci- sion by PfUDG are 70 ℃ and 9.0, respectively. The removal of U is inhibited by the divalent ions of Fe, Ca, Zn, Cu, Co, Ni and Mn, as well as a high concentration of NaC1. The phosphorothioates near uracil strongly inhibit the exci- sion of uracil by PfUDG. Interestingly, pfuDNA（Pyrococcusfuriosus DNA） polymerase, which tightly binds the ura- cil-carrying oligonucleotide, does not inhibit the excision by Pfl.IDG, suggesting PfUDG in vivo functions as the re- pair enzyme to excise uracil damage in genome.

稳定剂保护PCR扩增dU-DNA效果研究

目的 :了解 94℃灭活UDG与不灭活及扩增产物加稳定剂与不加稳定剂对DNA杂交效率的影响。方法 :采用微孔板DNA杂交技术检测PCR扩增dU -DNA杂交效果。以不加UDG组DNA杂交A值为对照、计算杂交百分率。结果 :不加UDG组扩增前后未经 94℃灭活处理 - 2 0℃保存 2 0h杂交效率为 90 .2 93% ,加UDG组在 4℃、室温、37℃放置 2 0h ,杂交效率为 2 0 .15 % ,2 1.37% ,2 9.37%。加UDG并增加 94℃灭活步骤、37℃水浴放置 2 0h ,杂交效率为 73.5 7% ,78.82 %。在此基础上加入稳定剂 37℃水浴 4 3h杂交效率达到 99.88%～ 10 0 %。 37℃水浴 6 7h杂交效率仍达到 86 .0 6 %～ 97.10 %。结论 :上述结果证实用于抗污染时 ,扩增前后增设 94℃灭活 10min可提高杂交效率。加入稳定剂可使杂交A值 1.80达到对照组A值 1.81水平。提示稳定剂对保护PCR扩增dU -DNA有极其重要作用。

类鼻疽伯克霍尔德氏菌UDPE检测方法的建立和应用

目的 建立防止产物污染的UDPE(UDG -DuplexPCR -EIA)技术 ,用于检测类鼻疽伯克霍尔德氏菌。方法 选择类鼻疽伯克霍尔德氏菌FUR(FerricUptakeRegulator)基因为靶序列 ,设计两对引物进行PCR扩增 ,用UDG(尿嘧啶糖基化酶 )防止PCR产物污染 ,并用微孔板杂交 -酶联显色检测扩增的PCR产物片段 ;用不同的模板考察方法的特异性和灵敏度。结果 该检测系统可以特异性地检测类鼻疽伯克霍尔德氏菌 ;对于纯DNA模板 ,检测灵敏度可以达到 10fg/ μl;对于系列稀释菌液提取的模板 ,灵敏度可达 0 1个菌 / μl;对于模拟污水标本、模拟组织标本和模拟土壤标本的检测灵敏度分别为 10个菌 / μl,10 0个菌 / μl和 10 0个菌 / μl;检测系统可以防止 10 9个PCR产物分子的污染 ;检测系统可以在 37℃下稳定保存 7d。结论 本研究建立了稳定的 ,防止产物污染 。

残留尿苷酶对HCV cDNA破坏作用的研究

为了解残留尿苷酶对dUTP掺入cDNAPCR产物的破坏作用。采用PAGE和DNA -EIA杂交技术检测抗污染效果和DNA杂交百分率。结果表明⑴每反应 0 2单位尿苷酶 37℃ 2 0min可获得良好的抗污染效果。⑵ 94℃ 10min可灭活尿苷酶的活性。对照组PCR产物室温放置 65h杂交效率为 94 18%。试验组 - 2 0℃保存 65h杂交效率为 87 69%、77 2 4 %、76 83% ,室温 65h杂交效率为 74 77%、72 50 %、70 2 9% ,对照组与试验组间比较差异有显著性 (P <0 0 5)。试验组间比较差异无显著性 (P >0 0 5)。以上结果证实对照组室温放置 65h杂交效率下降 5 82 % ,试验组 - 2 0℃保存下降 19 4 1% ,放置 65h下降 2 7 4 8% ,可能与残留尿苷酶有关。

疱疹病毒尿嘧啶DNA糖基化酶基因及其编码蛋白的研究进展

概述了疱疹病毒尿嘧啶DNA糖基化酶基因的特点、编码蛋白的基本功能和分布定位及与其他蛋白的相互作用的研究进展并进行了展望,以期为该基因的深入研究提供参考。认为,疱疹病毒尿嘧啶DNA糖基化酶基因属于早期基因,其编码的蛋白通过与其他蛋白相互作用共同完成DNA的修复与合成。

基因扩增技术中抗污染的研究

目的 了解残留UDG对dU -DNAPCR产物的影响及灭活UDG时对Taq -P的影响。方法 采用微孔板杂交技术检测dU -DNAPCR产物 3 7℃放置 2 0h杂交百分率 ;检测在 -2 0℃、4℃、室温、3 7℃时不同保存条件下的杂交百分率 ;94℃灭活 10min对Taq -P活性的影响。结果 加 0 2单位、1 0单位UDG组比不加UDG组杂交A值下降 13 2 81%～ 2 0 5 5 7%。t检验差异有显著性 (t=2 85 5 ,2 869,P <0 0 5 ) ;经 94℃灭活产物组 3 7℃杂交A值比 -2 0℃A值下降 5 5 47% ,未经 94℃灭活杂交A值下降 10 3 45 % ;94℃预变性 3 0s杂交A值为 98 714 %、10min 3 0s组杂交A值为 96 818%。结论 以上结果提示经 94℃加热灭活对PCR产物保存有重要作用 ,不仅对灭活UDG有作用而且还可灭活来源于UDG以外可破坏DNA的酶。表明含UDG组杂交A值比不加UDG组低13 2 81%～ 2 0 5 5 7%与UDG有关。