抗幽门螺旋杆菌尿素酶B亚单位(UreB)单克隆抗体抗原识别表位的初步鉴定

目的初步确定抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)单克隆抗体(mAb)6E6识别的抗原表位。方法采用截短法分段构建含UreB抗原的重组质粒,分别命名为U12,U13,U15,U16,U47。用IPTG诱导表达融合蛋白。对表达产物进行SDS-PAGE蛋白电泳及Westernblot分析。结果6E6能够分别识别1～300位氨基酸的U12片段,1～260位氨基酸的U16片段,1～230位氨基酸的U15片段,而不能识别1～200位氨基酸的U13片段和251～389位氨基酸的U47片段。结论mAb6E6抗体识别的抗原表位位于200～230位氨基酸。

幽门螺杆菌抗原基因ureB在乳酸菌中的克隆表达与免疫反应性研究

目的为了开发幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)口服疫苗,将Hp尿素酶B(UreB)在食品级乳酸乳球菌NZ3900菌株中进行表达,并研究其免疫反应性。方法 PCR扩增Hp MEL-HP27菌株ureB基因(基因号:FJ436980),将其克隆入大肠杆菌-乳酸乳球菌穿梭质粒pNZ8110中并转化乳酸乳球菌NZ3900;采用正交试验确定目的蛋白表达的适宜条件;应用western-blot鉴定其免疫反应性。结果成功扩增了Hp MEL-HP27菌株ureB基因,构建了ureB基因的乳酸菌NICE(Nisin-controlled expression)原核表达系统;UreB蛋白适宜的表达条件为:在ureB重组菌生长至对数生长前期(OD600≈0.3～0.4)加入终浓度为40ng/mL的nisin,诱导表达5h,可溶性UreB蛋白表达量最高,可达27.26μg/mL培养基。可溶性UreB蛋白的表达占上清蛋白的比例最高可达20.19%;Western-blot结果显示乳酸乳球菌表达的UreB抗原蛋白具有良好的免疫反应性。结论结果提示应用乳酸乳球菌构建幽门螺杆菌食品级疫苗可能具有较好前景。

人ureb1在大肠杆菌中高效表达及其抗体的制备

目的 :构建人的ureb1(hureb1)原核高效表达重组质粒 ,以此表达的外源蛋白为抗原制备抗ureb1的抗体。方法 :用XhoI/NotI从pGU 2质粒酶切得到hureb1的ORF与pGEX 4T 2的XhoI/NotI大片段连接 ,构建表达GST hureb1融合蛋白的重组载体。转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达。以粗制的GST hureb1融合蛋白分别免疫大白兔和小鼠 ,制备抗hureb1的多克隆抗体和单克隆抗体 ,采用WesternBlot进行特异性鉴定。结果 :构建了高效表达GST hureb1融合蛋白的原核表达载体 ,融合蛋白的表达量占菌体蛋白质总量的 33 45 %。以大肠杆菌表达的GST hureb1融合蛋白免疫动物制备了高滴度、高特异性的抗hureb1的抗体。结论 :利用重组GST hureb1融合蛋白免疫动物可获得高滴度的抗hureb1抗体。重组GST

人幽门螺杆菌UreB与Omp11双价疫苗载体的构建与鉴定

目的:构建含人幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)郑州分离株MELHP27ureB-omp11融合基因的重组表达载体。方法:利用分子克隆技术,扩增HpUreB、Omp11编码基因及融合基因ureB-omp11,将融合基因ureB-omp11与载体pET30a(+)进行酶切、连接,然后转化并筛选含有目的基因的重组载体。结果:酶切、测序分析表明,插入的基因片段为HpureB-omp11融合基因,由2280bp组成。与GenBank报道的相比,核苷酸序列同源性为99.39%,氨基酸序列同源性为99.47%。结论:成功构建了MELHp27融合蛋白UreB-Omp11的双价疫苗重组载体,为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了良好的基础。

人UREB1基因克隆及其在肿瘤组织中的分布

目的：大鼠 ＵＲＥＢ１基因编码的蛋白质能特异性地结合位于强吗啡基因启动子上游的一段 ＤＮＡ序列（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ，ＵＲＥ）。早期研究证实 ＵＲＥＢ１对强吗啡基因启动子的转录具有促进作用，而对ｐ５３的转录激活作用具有抑制效应。本实验目的就是克隆人ＵＲＥＢ１基因，探索其与肿瘤发生发展的关系。方法：利用人工合成寡核苷酸探针从人脑ｃＤＮＡ文库中筛选人ＵＲＥＢ１基因，应用大肠杆菌表达的重组蛋白质制备的抗体检测肿瘤组织中ＵＲＥＢ１的表达分布。结果：获得了人ＵＲＥＢ１基因，核苷酸序列在对应区域及氨基酸序列与大鼠ＵＲＥＢ１基因ｃＤＮＡ序列和氨基酸序列皆有９１％的同源性。在各种肿瘤组织中都有ＵＲＥＢ１的表达，但是表达水平及定位不一样。初步发现有这样一个规律，随着肿瘤的恶性程度增加 ＵＲＥＢ在１核内的聚集程度增加。 ＵＲＥＢ１的酪氨酸磷酸化分析结果显示，肿瘤恶性程度高，ＵＲＥＢ１的酪氨酸磷酸化程度高。结论：ＵＲＥＢ１可能参与肿瘤的发生发展，其酪氨酸磷酸化水平可以影响肿瘤的恶性程度。

幽门螺杆菌UreB核酸疫苗的构建

目的 :构建含幽门螺杆菌 (H elicobacter pylori,Hp)尿素酶 B亚单位 (Ure B)基因的核酸疫苗。方法 :抽提 Hp标准菌株 CCUG1 7874基因组 DNA,应用 PCR技术从基因组 DNA扩增 U re B基因 ,克隆入 PUCm T载体 ,检测 U re B基因序列。经过一系列酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体 p IRES,转入感受态大肠杆菌 DH5 α,筛选阳性克隆 ,通过 PCR和酶切反应进行鉴定。通过脂质体法将构建好的重组载体 p IRES- Ure B转染 COS- 7细胞 ,Western印迹分析检测 p IRES- U re B表达 Ure B蛋白的免疫原性。 结果 :扩增出长约 1 70 0 bp的 U re B基因 ,与基因库 Hp U re B序列一致 ,PCR和酶切鉴定结果证实成功构建了含 U re B基因的 Hp核酸疫苗 p IRES- U re B,并且 Western印迹分析检测到特异性的蛋白条带。结论 :构建了具有免疫反应性 Ure B基因的 Hp核酸疫苗 。

幽门螺杆菌UreB和HspA DNA疫苗的构建及免疫评价

本研究选择幽门螺杆菌尿素酶B和热休克蛋白A为候选抗原,通过PCR扩增基因,克隆至真核表达质粒pCD-NA3.1(-)His-Myc上,构建成DNA疫苗。通过小鼠免疫效果的评价,获得两株具有免疫源性DNA疫苗。

ctxB和ureB抗原表位的融合表达及其免疫学活性

为研制新型有效的幽门螺杆菌疫苗,设计了一个由ctxB(去除信号肽部分)和ureB抗原表位融合的新型分子。PCR扩增霍乱弧菌的ctxB基因,插入到质粒pET32a上,再将化学合成的ureB抗原表位序列(编码的氨基酸为CHHLDKSIKEDVQFADSRI)连接到ctxB下游,融合基因命名为ctube。将含有融合基因的pET32a转化到大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达后SDS-PAGE测定融合蛋白ctube的分子质量,ELISA法检测ctube对神经节苷脂GM1的结合活性,Western blotting检测对兔抗幽门螺杆菌(Hp)多抗的结合活性。序列分析结果表明,ctube基因全长387bp,编码129个氨基酸,其中ctxB的密码子与GenBank上的序列同源性达到99％。转化后的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导表达后,产生了一个分子质量为2.5万的蛋白,经肠激酶酶切后的产物为ctube。ELISA试验和West Blotting表明,ctube与神经节苷脂性GM1、兔抗Hp多抗均具有很好的结合活性,有希望成为一个具有抗幽门螺杆菌感染的新的活性分子。

幽门螺杆菌UreB基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 :为了研制口服幽门螺杆菌疫苗 ,构建表达幽门螺杆菌的保护性抗原成分UreB蛋白的基因工程菌株。方法 :用PCR方法扩增UreB基因片段 ,将其克隆至pET2 8a质粒上 ,转化E .coliBL2 1(DE3) ,经IPIG诱导表达 ,得到rUreB蛋白。结果 :经测序 ,UreB基因片段由 1710bp组成 ,编码 5 6 9个氨基酸残基。与GenBank报道的脲酶核苷酸序列同源性最高为 97% ,氨基酸同源性为 99%。经SDS PAGE检测表明 ,rUreB基因表达的蛋白质相对分子质量约为 6 4kDa ,含量占细菌总蛋白的 2 9 5 %。经Ni2 +柱亲和层析、GSH复性后 ,rUreB表现了脲酶活性 ,活性为 32 5U/mg。结论 :表达产物确为幽门螺杆菌脲酶B亚基 ,这为研制幽门螺杆菌口服疫苗打下了基础。

重组幽门螺杆菌ureA,ureB低温表达、纯化及抗原鉴定

目的 :建立经济有效的方法 ,从大肠杆菌表达、纯化重组幽门螺杆菌尿素酶A、B亚单位。方法 :含重组表达质粒pGEX- 2T ureA ,pGEX - 2T ureB大肠杆菌分别在不同浓度IPTG、不同温度条件下作诱导培养 ,以SDS -PAGE分析表达产物 ,采用谷胱甘肽 -Sepharose 4B亲和层析分离纯化表达产物 ,以Western -blotting和ELISA对纯化产物作抗原性分析鉴定。结果 :IPTG诱导浓度为 0 .1mmol L ;诱导温度为 2 8℃ ,含重组质粒大肠杆菌表达可溶性融合蛋白GST -ureA、GST -ureB各约占总表达产物的 78%和87%。经亲和层析 ,得纯度 90 %以上的GST -ureA约为 14mg L ,GST -ureB约为 18mg L ;融合蛋白呈ureA、ureB抗原性反应。结论 :建立了低温诱导及纯化高纯度ureA、ureB基因表达产物的方法 ,所得纯化产物具有ureA、ureB抗原活性 ,为进一步的应用研究打下基础。

幽门螺杆菌ureB基因的草莓转化研究

建立了农杆菌介导利用潮霉素抗性作为筛选标记的草莓转化系统。以草莓叶片为材料,把Helicobacter pylori的ureB基因连接到CaMV35S启动子后构成pCAMBIA13011-ureB表达载体,通过根癌农杆菌EHA105介导叶盘法转化草莓,经共培养和潮霉素抗性筛选,得到60株抗性植株。对所得植株进行PCR检测,表明阳性苗比例为42%。RT-PCR结果进一步证明目的基因在T0代转化植株中已经转录。

乳酸菌中幽门螺杆菌ureB基因的食品级表达与优化

目的:以乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)为宿主菌构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylo-ri)尿素酶B(UreB)的食品级表达系统。方法:从重组质粒pMD19-T-ureB上酶切得到ureB基因片段,与含有筛选标记lacF基因的L.lactis表达载体pNZ8149经双酶切后定向连接,应用PCR、酶切和测序的方法鉴定重组子。重组菌用乳联菌肽诱导表达,用正交表实验进行表达条件的优化,通过SDS-PAGE和Western blot对重组蛋白进行鉴定。结果:重组菌NZ3900/pNZ8149-ureB经鉴定与预期相符。优化结果显示在菌体培养到D600nm为0.40左右时加入终浓度为25μg/L的乳联菌肽诱导5h产量最高,通过Western blot能检测到UreB的表达。结论:构建了ureB基因食品级表达系统,并得到了表达的最优条件。

不同幽门螺杆菌菌株ureB和hspA基因同源性分析

目的研究不同来源幽门螺杆菌菌株的ureB基因和hspA基因的同源性。方法在GenBank中调取全球来源于幽门螺杆菌不同菌株的ureB基因序列23个和中国境内来源于幽门螺杆菌不同菌株的hspA基因序列20个,利用ClustalW 2生物软件,分别对ureB基因和hspA基因序列进行同源性比较分析,并建立基因进化树,分析其特点。结果不同国家之间ureB基因序列并不一致,同一国家ureB基因序列相似性较高;中国境内hspA基因序列相似性程度很高。结论中国境内不同幽门螺杆菌菌株ureB基因序列和hspA基因序列的相似性程度都很高,都具有很高的同源性。

幽门螺杆菌UreB-Omp11融合蛋白的表达、纯化与免疫学活性检测

目的:在大肠杆菌TB1(pMAL-c2X)中表达幽门螺杆菌(Hp)UreB-Omp11融合蛋白,并探索其免疫学活性,为Hp基因工程疫苗的研制奠定基础。方法:以重组质粒pET30a(+)-ureB-omp11为模板获得融合基因ureB-omp11片段,并插入到原核表达载体pMAL-c2X中进行融合蛋白的表达,用Amylose亲和层析法纯化融合蛋白,纯化的融合蛋白辅以免疫佐剂皮下免疫小鼠,蛋白印记法对免疫小鼠血清进行检测。结果:特异PCR法和酶切鉴定证实融合基因ureB-omp11克隆入表达载体pMAL-c2X中;重组菌TB1(pMAL-ureB-omp11)经诱导获得了高效表达的MBP-UreB-Omp11融合蛋白,该融合蛋白可以被Hp免疫小鼠血清的相应抗体所识别,纯化后的融合蛋白纯度达90%以上。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后,与纯化的融合蛋白进行杂交,结果显示在134000处出现特异杂交带,融合蛋白具有良好的免疫学活性。结论:成功构建了HpMELHP27融合蛋白UreB-Omp11的重组疫苗候选株TB1(pMAL-ureB-omp11),为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了良好的基础。

重组原核表达质粒pTrc99A-ureB/hlyE的构建和表达

目的 构建表达幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)尿素酶B亚单位 (ureB)基因与大肠杆菌K - 12株hlyE基因融合表达的原核表达质粒 pTrc99A -hlyE 并表达。 方法 用PCR扩增hlyE基因 ,经酶切连接反应将其克隆入重组原核表达质粒并测序 ,与GenBank中的核酸和蛋白序列进行BLAST分析 ,重组的阳性克隆经IPTG诱导培养 ,SDS -PAGE电泳进行表达分析 ,薄层扫描分析融合蛋白的含量。结果 对重组质粒进行酶切和PCR检测 ,证明构建了携带hlyE及ureB基因的重组原核表达质粒 pTrc99A -ureB/hlyE ,核酸序列测定及同源性分析证实所构建的原核表达质粒pTrc99A -ureB/hlyE中所含的Hp -ureB及hlyE与GeneBank中的Hp -ureB和hlyE序列的同源性分别为 97 4 2 % (16 6 3/ 170 7)、99% (910 / 918)。重组细菌JM10 9可表达约 10 0kD的融合蛋白ureB/hlyE ,含量占全菌体蛋白含量的 15 5 %。 结论 构建并鉴定了原核表达质粒pTrc99A -hlyE并高效表达 。

小鼠口服重组LTB和HpUreB免疫活性的研究

目的 观察重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 (rLTB)的粘膜佐剂活性以及重组Hp尿素酶B亚单位 (rUreB)的免疫学活性 ,为制备安全有效的Hp疫苗奠定基础。方法 ELISA检测rLTB的GM1(神经节苷脂 )结合活性 ,利用本室基因工程重组表达的rLTB和rUreB口服免疫BALB/c小鼠后 ,在第 4和 /或 5周ELISA方法检测血清IgG ,以及唾液、粪便抽提物、肠粘液sIgA水平。采用3 H掺入实验 ,检测小鼠脾脏淋巴细胞对特异性抗原的增殖反应。结果 ①rLTB具有GM1结合活性。②与不加佐剂的对照比较 ,加rLTB的实验组 ,能够有效地诱发唾液及肠道sIgA的产生。③口服HprUreB抗原能够刺激小鼠产生特异性的IgG和sIgA。④3 HT dR掺入实验提示加佐剂组较不加佐剂组 ,脾脏淋巴细胞对特异性抗原的增殖反应更强。⑤不加佐剂组血清IgG ,免疫第 5周较第 4周高 ;加佐剂则是第 4周比第 5周高。结论 重组LTB具有良好的粘膜佐剂功能 ;HprUreB具备良好的免疫原性 ;小鼠口服rLTB和rUreB后可以产生保护性sIgA ;

幽门螺杆菌UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株构建和融合蛋白的表达、纯化及免疫学活性

目的:构建幽门螺杆菌(Hp)UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株,在大肠杆菌中表达UreB-Omp11融合蛋白,并检测其免疫学活性。方法:用PCR方法扩增郑州分离Hp菌株MEL-HP27的ureB和omp11基因并用重叠延伸PCR法获得ureB-omp11融合基因,将融合基因ureB-omp11插入原核表达载体pET30a(+)、pET28a(+)及pMAL-c2X中,筛选出合适的表达系统并进行融合蛋白的表达,采用Western blot对表达产物进行鉴定,并用Amylose亲和层析法纯化融合蛋白,应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析,纯化的融合蛋白辅以免疫佐剂皮下免疫小鼠,Western blot对免疫小鼠血清进行检测。结果:特异PCR法、酶切鉴定并经测序分析后证实融合基因ureB-omp11克隆入表达载体pET30a(+)、pET28a(+)与pMAL-c2X中;重组菌TB1(pMAL-ureB-omp11)经诱导获得了高效表达的MBP-UreB-Omp11融合蛋白,该融合蛋白可以被Hp免疫小鼠血清和Hp阳性患者血清中的相应抗体所识别,纯化后的融合蛋白纯度达90%以上。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后,与纯化的融合蛋白进行杂交,结果显示在Mr134000处出现特异杂交带,融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。结论:成功地构建并筛选出了HpMELHP27融合蛋白UreB-Omp11的重组疫苗候选株TB1(pMAL-ureB-omp11),为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了基础。

幽门螺杆菌ureB基因转染胃上皮细胞及其对细胞的作用

研究幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)ureB基因重组子转染胃上皮细胞后对胃上皮细胞的作用。用PCR方法从Hp标准株NCTC116 37中获取ureB全长基因 ,将其开放读码框架定向克隆入真核表达载体pcDNA3 1;获得的重组子转染SGC 790 1细胞 ,筛选耐潮霉素的细胞克隆 ,用RT PCR方法检测细胞内ureB基因在转录水平的表达 ;分别用荧光染色技术、MTT、流式细胞术检测UreB对细胞表型、增殖、凋亡及细胞周期的影响。UreB阳性表达的细胞 (SureB)胞膜出芽、细胞皱缩 ;用MTT法检测细胞增殖 ,结果表明 ,SureB细胞与SpcDNA3 1细胞比较 (pcDNA3 1转染的细胞 ) ,生长增殖无显著性差异 (P >0 0 5 ) ,流式细胞术检测细胞凋亡结果显示 ,SureB的凋亡率显著高于SpcDNA3 1(P值为 0 0 0 7) ;细胞周期分析显示 ,SureB细胞有S期比率增高、G2 M、G0 G1 期比率下降的趋势。

幽门螺杆菌融合基因hspA-ureB重组质粒的构建及其编码蛋白抗原性预测

目的 :构建幽门螺杆菌 (H .pylori)郑州分离株MEL HP2 7的hspA ureB融合基因的克隆 ,并运用生物信息学软件预测融合蛋白HspA UreB的空间结构和抗原性。方法 :从重组质粒pNHA2 7和pNUB2 7分别纯化回收hspA和ureB基因片段 ,并以hspA ureB的顺序插入温控表达载体pBV2 2 0中 ,用质粒酶切电泳和特异PCR方法鉴定重组质粒。利用生物信息学软件和Genbank数据库分析hspA ureB表达蛋白的抗原性和空间结构。结果 :质粒酶切电泳和特异PCR均可见 2 .0 6kb的融合基因片段。生物学软件分析显示 :MEL HP2 7融合蛋白HspA UreB的长度为 6 89个氨基酸 ,蛋白相对分子质量为 76 5 0 0 ,等电点为 5 .79,具有 5个抗原活性结构域。结论 :成功构建了MEL HP2 7融合蛋白HspA UreB的重组表达质粒 ,编码融合蛋白具有典型抗原分子的结构特征 ,有望成为H .pylori疫苗候选抗原。

幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的在大肠杆菌中表达幽门螺杆菌(简称Hp)HspA-UreB融合蛋白,并探索其免疫反应性,为Hp基因工程疫苗的研制奠定基础。方法用PCR方法扩增郑州分离Hp菌株MEL-HP27的hspA和ureB基因,分别克隆入pNEB193中。测序后,回收两种基因片段,并以hspA-ureB的顺序连接插入原核表达载体pMAL-C2x进行融合表达。采用蛋白印迹法对表达产物进行鉴定。结果特异PCR法和酶切鉴定证实融合基因hspA-ureB克隆入表达载体中;重组质粒转化大肠杆菌TB1后,经IPTG诱导3h,SDS-PAGE电泳显示在119kDa处出现一条特异蛋白带,即麦芽糖结合蛋白(MBP)与HspA-UreB的融合表达形式,约占细菌总体蛋白含量的31%;该融合蛋白与Hp免疫小鼠血清和Hp阳性病人血清的Westernblot分析结果显示,在119kDa处出现特异杂交带。结论成功地在大肠杆菌中实现了Hp融合蛋白HspA-UreB的高效表达,并证实其具有良好的免疫反应性。