putA与vgb基因对反式-4-羟基-L-脯氨酸产量的影响

反式-4-羟基-L-脯氨酸是在自然界中分布最广泛的一种羟脯氨酸,在医药、化工、食品和美容业等领域有广泛应用。为了在生物转化法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的过程中减少菌体对底物脯氨酸的降解,利用Red/ET同源重组系统敲除putA基因,并比较野生型菌株与缺失型菌株在不同培养基中的反式-4-羟基-L-脯氨酸产量,再引入vgb基因,考察该基因对反式-4-羟基-L-脯氨酸产量的影响。结果表明:putA基因的缺失能阻止菌体降解脯氨酸;碳源充足的情况下,GC培养基更有利于反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产;putA基因缺失型菌株能将被消耗的脯氨酸全部转化为反式-4-羟基-L-脯氨酸;vgb基因的存在能显著提高反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量。

抗骨形成蛋白(BMP)单链抗体的构建

从一株鼠抗ＢＭＰ单克隆抗体杂交瘤中扩增出其可变区基因片段，并将其分别克隆入ｐＵＣ１８、１９载体，利用双脱氧链终止法进行序列测定和计算机分析后，应用一段人工合成的含１５个氨基酸的连接肽，将重链基因（ＶＨ）的Ｃ端和轻链基因（ＶＬ）的Ｎ端连接起来，构建成单链抗体（ｓｃＦｖ）。将其克隆入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１，在大肠杆菌ＪＭ１０９中获得初步表达。

hTNF-α单克隆抗体轻、重链可变区基因的克隆和序列及分子结构分析

从两株具有高亲和力及中和活性的抗人肿瘤坏死因子－α（ｈＴＮＦ－α）的单抗杂交瘤细胞株１Ｃ３、３Ｆ６中分别提取总ＲＮＡ，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增并克隆了抗体的ＶＬ、ＶＨ基因。核苷酸序列分析表明，所克隆基因均为抗体的ＶＬ、ＶＨ基因，并分别属于Ｋａｐｐａ链Ⅳ亚组和重链Ⅲ（Ｄ）亚组。此外，两抗体可变区分子模型及与ｈＴＮＦ－α的结合模型的建立及分析，为进一步的基因工程抗体研究及抗原－抗体相互作用机理的研究奠定了基础。

小鼠BMP-McAb可变区基因的体外扩增、克隆与序列分析

从体外培养的ＢＭＰＭｃＡｂ杂交瘤中提取细胞总ＲＮＡ，反转录成ｃＤＮＡ。以ｃＤＮＡ为模板，利用两对根据免疫球蛋白重链与轻链可变区５′端序列和Ｊ区序列设计合成的引物，通过ＰＣＲ方法，扩增出抗体重链、轻链可变区基因片段（ＶＨ，ＶＬ）。将扩增产物分别克隆入ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９质粒，筛选出阳性克隆，利用双脱氧链终止法进行序列测定，经计算机分析，ＶＨ基因全长为３４５ｂｐ，编码１１５个氨基酸；ＶＬ基因全长为３１５ｂｐ，编码１０５个氨基酸。

抗日本血吸虫膜蛋白单克隆抗体NP11-4轻链可变区基因的分离克隆及测序研究

本文报告了从抗日本血吸虫单抗NP11- 4杂交瘤细胞株的基因组DNA中 ,用PCR技术扩增出抗体轻链可变区基因 ,并克隆至pUC19质粒中进行测序分析。研究表明 :该基因长 336bp ,编码 112个氨基酸 ,经结构分析及与抗体库中一般序列的比较 ,证实该序列为轻链可变区基因 ,属κ轻链SubgroupII亚类 ,由种系基因中的V与Jκ 2基因重排而成。

含人APOBEC3F启动子荧光素酶报告基因载体的构建

目的构建含人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3F(apolipoprotein B mRNA editing enzyme,catalytic polypeptide-like3F,APOBEC3F)基因启动子的萤光素酶报告基因载体。方法应用5'cDNA末端快速扩增分析(5'rapid am-plification of cDNA ends,5'RACE)技术确定APOBEC3F转录起始位点,利用PCR技术扩增人APOBEC3F启动子序列,构建含人APOBEC3F启动子的萤光素酶报告基因载体,行双酶切及测序鉴定,并通过双萤光素酶报告基因系统检测启动子活性。结果 APOBEC3F基因转录起始位点位于GenBank已公布的APOBEC3F cDNA起始位置上游13个核苷酸处,测序结果表明克隆获得的APOBEC3F基因启动子序列与GenBank报道一致。重组载体pGL3-A3F-Prom组F/R值(0.342082±0.023516)与空载体pGL3-basic组(0.007871±0.002357)相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建了含人APOBEC3F基因启动子的萤光素酶报告基因载体,为更深入研究APOBEC3F基因转录调控机制奠定了基础。

抗甜菜坏死黄脉病毒单抗轻链可变区基因的克隆及全序列测定

The results showed that PCR product was 318 bp V L gene of monoclonal antibody against beet necrotic yellow vein virus, code 106 amino acids. V L gene belongs to a k chain subelass Ⅱ of mouse, frame region had 85% homogenous with the published sequencing of V L gene of mouse and was in accord with structural characteristics of V L of mouse.

油菜黑胫病抗性相关基因BnWRKY70的功能研究

WRKY转录因子是植物信号传导过程中的重要成员,在植物抗病过程中发挥着重要作用。为了解BnWRKY70在油菜黑胫病抗性反应中的作用机理,本研究对油菜响应黑胫病菌侵染产生的特异基因BnWRKY70进行序列分析;将克隆得到BnWRKY70基因CDS 308bp特异区段,利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)载体构建了基于病毒诱导的油菜基因沉默体系;利用qRT-PCR验证目的基因的表达水平;最后进一步通过表型观察和病情指数统计分析评价BnWRKY70基因沉默植株在接种黑胫病菌之后油菜的抗病性。结果表明,BnWRKY70基因最长ORF为858bp,编码285个氨基酸,含有一个WRKY保守结构域,属于Ⅲ类WRKY转录因子。BnWRKY70基因沉默后的表达量显著下降,说明在油菜中成功构建了VIGS体系。表型观察发现基因沉默油菜株系叶片比未沉默株系更易感病,病斑面积更大,且病情指数显著高于对照,说明BnWRKY70基因沉默减弱了油菜的抗病性。本研究为揭示BnWRKY70在油菜病原菌分子互作机制中的作用奠定基础。