鼠疫耶尔森菌低钙应答V抗原人源单克隆抗体筛选与鉴定

目的筛选抗低钙应答V抗原(LcrV)的人源单克隆抗体,分析抗体基因特点,检测抗体与抗原结合的特异性、亲和力及功能。方法使用PCR方法从鼠疫疫苗临床试验志愿者外周血细胞cDNA扩增抗体轻、重链可变区基因片段,构建ScFv噬菌体抗体文库。用LcrV对文库进行富集筛选,将获得的抗体基因表达成人IgG1后,测定抗体与LcrV抗原结合的特异性、亲和力、免疫调节功能以及保护能力。结果成功构建了鼠疫耶尔森菌人源ScFv抗体文库,库容量为7.54×10^(8)。抗体文库经LcrV筛选后获得了3株抗LcrV抗体,命名为RV-B4、RV-D1和RV-E8。3株抗体重链为VH1-46和VH3-30,轻链分别为VL1-51、VK3-20和VK1-39。3株抗体经ELISA及Western blot验证均与LcrV特异性结合,其与V抗原结合的解离常数(KD)分别为2.1 nmol/L、1.24 nmol/L和42 nmol/L。RV-D1体外降低人THP-1分泌TNF-α,动物攻毒试验中未发现抗LcrV抗体的保护效果。结论从鼠疫疫苗免疫人群获得了靶向低钙应答V抗原的人源抗体,以结合抗体为主,不能有效阻断病菌感染。所获得的单抗为鼠疫免疫基础研究、鼠疫诊断应用提供了候选材料。

鼠疫菌V抗原基因在大肠杆菌中的克隆及表达

从鼠疫杆菌野毒株总DNA中利用PCR方法扩增出V抗原编码基因 ,将此基因克隆到大肠杆菌的表达质粒pET 42b( + )中 ,经IPTG诱导后 ,在大肠杆菌BL2 1 (DE3)细胞中成功地表达出鼠疫菌V抗原蛋白。目的蛋白表达量占菌体总蛋白的 32 8%。

鼠疫菌重组质粒pcDNATE/F1-V的构建及其免疫效果的研究

目的获得含有鼠疫F1和V抗原编码基因的重组质粒pcDNATE/F1-V,并测定其诱导特异性免疫应答的能力。方法PCR扩增鼠疫菌F1和V编码基因,分别与pGEM-T连接测序,构建pcDNATE/F1-V融合重组质粒,转染COS-7细胞,用Westernblot方法鉴定目的蛋白的表达,重组质粒pcDNATE/F1-V加集落刺激因子(GM-CSF)免疫Balb/c小鼠,观察免疫效果。结果pcDNATE/F1-V在COS-7细胞中表达,免疫鼠体内产生特异性抗体,抗体亚型分析、细胞因子等指标的测定结果表明所构建DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主。结论成功构建重组真核表达质粒pcDNATE/F1-V,其具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,为鼠疫菌新型疫苗研制奠定了基础。

人tPA信号肽和Yersinia pestis保护性抗原F1-V融合基因的构建及其免疫效果观察

为获得含有鼠疫F1和V抗原编码基因,以及人tPA信号肽基因的重组质粒tPA-pVAX1/F1-V,测定其诱导特异性免疫应答的能力,用PCR扩增鼠疫菌F1和V编码基因,分别与pGEM-T连接测序.构建pVAX1/F1-V融合重组质粒,PCR扩增tPA信号肽片段,并将其插入到F1-V的上游,构建tPA-pVAX1/F1-V融合重组质粒;转染COS-7细胞,Western印迹法鉴定目的蛋白的表达,重组质粒tPA-pVAX1/F1-V加GM-CSF佐剂免疫BALB/c小鼠,观察免疫效果.400个LD50强毒鼠疫菌皮下攻毒观察保护率.结果表明,tPA-pVAX1/F1-V在COS-7细胞中表达;免疫鼠体内产生特异性抗体;抗体亚型分析、细胞因子等指标的测定表明,所构建DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主;(攻毒保护率达90%.结果提示,已成功构建F1-V融合蛋白真核表达载体tPA-pVAX1/F1-V,它具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,对强毒鼠疫菌皮下攻毒有一定的保护效力,为鼠疫菌新型疫苗研制奠定了基础.

罗汉果甜苷V人工抗原免疫原性检测法的建立与评价

目的制备罗汉果甜苷V(mogroside V,MogV)-载体蛋白复合物人工抗原及抗血清,建立抗血清与MogV特异性反应的检测方法,为进一步制备MogV的单克隆抗体、建立快速检测MogV的ELISA法提供技术基础。方法将MogV与丁二酸酐、载体蛋白牛血清蛋白(BSA)和人血清蛋白(HSA)反应偶联,制得半抗原-载体蛋白复合物后,通过紫外扫描光谱计算出结合的半抗原数目;以此抗原免疫Balb/c小鼠,制备抗血清,并通过ELISA法检测效价和特异性。结果合成的人工抗原MogV-HS-BSA结合比约为44∶1,MogV-HS-HSA结合比约为64∶1;通过免疫小鼠得到特异性针对MogV的抗血清,血清效价较高。结论 MogV人工抗原有较好的免疫原性,建立的免疫原性检测方法简便可行。

鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原的制备及其免疫保护效果的研究

为制备鼠疫耶尔森氏菌F1-V重组融合蛋白抗原,观察其免疫原性和免疫保护效果,通过疏水层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析纯化鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原.用氢氧化铝凝胶吸附制备试验性鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原,皮下接种健康BALB/c小鼠,ELISA检测血清F1-V抗体效价、MTT法测定淋巴细胞增殖能力,进一步用400LD50鼠疫耶尔森氏菌141标准毒株皮下攻毒,观察动物的存活情况.通过三步柱层析纯化获得的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原纯度达到90%以上.氢氧化铝凝胶吸附的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原免疫BALB/c小鼠三次,血清抗F1-V抗体效价为1∶(51200±800),对耶尔森氏菌141强毒株攻击的保护率是90%.上述结果表明,制备的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原具有良好的免疫原性和免疫保护效果,为研制鼠疫F1-V重组融合蛋白疫苗奠定了基础.

重组鼠疫菌V抗原的纯化及其豚鼠免疫保护力初探

采用Ni2 +亲和层析方法 ,对用工程化大肠杆菌BL2 1(DE3)表达的重组鼠疫菌V抗原进行纯化 ,目标蛋白纯度达到 90 %以上。以氢氧化铝凝胶配制吸附疫苗 ,经二针次肌内注射免疫实验豚鼠后 ,对皮下注射 4 0 0个致死剂量 (MLD)强毒鼠疫菌攻击有一定保护效力 ,存活率为 2 0 %。结果表明 。

米非司酮和利洛司酮诱导异位子宫内膜间质细胞Fas及Annexin V表达的研究

目的 :观察抗孕激素米非司酮和利洛司酮在不同浓度和作用时间下 ,对异位子宫内膜间质细胞Fas和钙磷脂结合蛋白V表达的影响。方法 :应用ELISA法检测培养基上清液中Fas蛋白的浓度。应用流式细胞仪检测AnnexinV表达。结果 :抗孕激素各药物浓度组Fas表达显著高于对照组 (P <0 .0 5 ) ,且Fas浓度呈时间 剂量依赖性升高。抗孕激素10 - 6 mol/L和 10 - 5mol/L浓度组异位间质细胞AnnexinV表达显著高于对照组 (P <0 .0 5 ) ,并呈时间 剂量依赖性增加。抗孕激素 10 - 5mol/L时培养异位子宫内膜间质细胞 4 8h和 72h ,利洛司酮组AnnexinV表达显著高于米非司酮组 (P <0 .0 5 )。结论 :米非司酮和利洛司酮以时间和剂量依赖性方式促进异位子宫内膜间质细胞凋亡。这两种药物可能通过上调Fas蛋白表达促进异位间质细胞凋亡。

鼠疫耶尔森菌F1-V融合蛋白改构体的构建、原核表达及纯化

目的：通过基于结构的基因突变获得鼠疫耶尔森菌F1抗原突变体（F1mut）,克隆、表达并纯化F1mut-V融合蛋白。方法：通过3轮PCR,将编码F1抗原分子N端1~14位氨基酸的基因序列移到3＇端,测序无误后将F1mut基因与V基因的5＇端连接,构建改构的融合基因F1mut-V,将其克隆到原核表达载体p ET-32a后转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后,目的蛋白为可溶性表达,通过硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析、疏水相互作用层析和凝胶过滤层析纯化,用SDS-PAGE和Western印迹分析纯化产物。结果：重组F1mut-V在大肠杆菌中为可溶性表达,表达量占全菌蛋白的25%以上,纯化后目的蛋白的纯度达95%,经Western印迹检测,与抗V、F1抗体均有特异性结合。结论：重组F1mut-V有望成为新一代亚单位疫苗的有效成分。

结直肠癌中CD_(44) V_6 PCNA的表达及其与浸润转移的关系

目的 探讨CD44V6和PCNA在结直肠癌中的表达及其与肿瘤浸润转移的关系。方法 应用免疫组织化学S P法检测 87例结直肠癌组织中CD44V6和PCNA的表达情况。结果 87例结直肠癌组织中CD44V6蛋白的表达阳性率为 5 8.6 % ,PCNALI为 5 6 .5 1± 18.82。CD44V6阳性表达率和PCNALI在侵及浆膜层者明显高于侵及肌层者 ,淋巴结转移阳性组高于淋巴结转移阴性组 ,DukesC、D期明显高于A、B期 ,差异均有显著性 (P <0 .0 5 )。PCNA高LI者CD44V6阳性率明显高于PCNA低LI者 ,有显著性差异 (P <0 .0 5 )。结论 CD44V6和PCNA在结直肠癌浸润转移过程中发挥重要作用 ,可作为反映结直肠癌恶性程度的生物学标记物。

番鸭源禽1型副黏病毒HN基因主要抗原结构域和V基因融合表达载体的构建

为构建番鸭源禽1型副黏病毒HN主要抗原结构域(HNd)和V基因融合表达载体,经PCR及融合PCR分别从重组质粒pMDHN和pMDP中扩增HN基因主要结构域和V基因cDNA。将HNd经KpnⅠ和BamHⅠ双酶切、V基因用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,分别定向插入真核载体pcDNA3的多克隆位点相应的酶切位点中,对2个单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV进行酶切和测序鉴定。利用融合PCR技术扩增出HNd-V基因,定向克隆至pcDNA3的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切酶切位点之间,转化感受态细胞后,经PCR反应初筛后,对阳性克隆进行酶切分析及测序鉴定。对单表达重组质粒进行酶切分析及测序鉴定,结果表明:HNd和V基因已被正确定向克隆至真核表达载体pcDNA3,成功构建了2个基因的单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV;对融合重组质粒酶切分析和测序鉴定表明,HNd-V融合基因正确克隆进真核表达质粒pcDNA3中,成功构建了融合表达载体pcDNAHNd-V。

^99mTc(V)-DMSA与^99mTc-HYNIC-TOC显像诊断甲状腺髓样癌术后复发和转移价值的对比研究

目的:该研究旨在比较^(99m)Tc(V)-DMSA与^(99m)Tc-HYNIC-TOC在定位甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma,MTC)术后复发和转移灶中的诊断价值。方法:回顾性分析2013年7月—2016年10月24例因术后复发或转移而来复旦大学附属肿瘤医院同期行^(99m)Tc(V)-DMSA(以下简称DMSA)和^(99m)Tc-HYNICTOC(以下简称TOC)显像的MTC患者。通过对比显像结果与手术病理或临床随访资料,来判断两种显像方法的应用价值。结果:基于患者的研究中,DMSA和TOC的灵敏度分别为62.5%和37.5%,差异有统计学意义(P=0.031);基于病灶(n=44)的研究中,前者灵敏度(93.2%)高于后者(43.2%)(P<0.000 1)。以降钙素水平500 pg/m L为界将病灶分成两组,当降钙素水平≤500 pg/m L(n=11)时,DMSA和TOC的灵敏度分别为81.8%和18.2%(P=0.016);当降钙素水平>500 pg/m L(n=33)时,两者灵敏度分别为97.0%和51.5%(P<0.000 1)。对于软组织病灶(n=36),DMSA灵敏度高于TOC(P<0.000 1);对于骨病灶(n=8),两者灵敏度差异无统计学意义(P=0.219)。结论:DMSA在定位MTC患者复发或转移灶中具有较高的灵敏度,优于TOC。

A549和SK-OV-3细胞株中CD44v6、整合素αvβ3、EGFR及E-钙黏素的表达差异与远处转移关系

目的探讨肺癌A549细胞株和卵巢癌SK-OV-3细胞株中CD44v6、整合素αvβ3、EGFR及E-钙黏素的表达水平差异及其与肺癌和卵巢癌远处转移的关系。方法利用流式细胞仪分组检测A549细胞株和SK-OV-3细胞株中CD44v6、整合素αvβ3、EGFR及E-钙黏素的表达水平。结果 A549细胞株中CD44v6、整合素αvβ3、EGFR和E-钙黏素的表达阳性率均高于SK-OV-3细胞株[(93.48±2.97)%、(95.42±2.26)%、(94.30±3.43)%、(94.52±1.59)%vs(82.73±4.28)%、(83.60±1.26)%、(88.52±0.88)%、(86.96±3.07)%,均P<0.05]。结论促转移分子CD44v6、整合素αvβ3、EGFR以及抑制转移分子E-钙黏素在A549细胞株的表达均高于SK-OV-3细胞株,这可能是肺癌比卵巢癌更容易发生远处转移特别是脑转移的部分分子机制。

ELISA双抗夹心法检测IBDV抗原

采用IBD细胞毒油佐剂灭活苗多次免疫易感鸡，制取高免血清效价1：64，提纯IgG抗体并用HRP标记同一IgG抗体，建立一种检测IBDV的敏感性方法──ELISA双抗夹心法。实验用盐析法和离子交换层析法纯化IgG。酶标抗体E／IgGmol比1：43。方阵实验确定最佳反应条件；包被抗体50ug／ml，E－Ab2稀释度为1：120，Ag灵敏度为1：3200；取代反应，抗原阻断反应，无关病毒对照试验均为阴性，并与AGP法对照实验．灵敏度高200倍。以上结果表明：本实验敏感性高，特异性强，简单快速判定客观，对临床诊断IBD流行病有很好的使用价值和推广价值。

结核分枝杆菌EsxV亚单位疫苗黏膜免疫诱导的免疫应答

目的研究结核分枝杆菌抗原Rv3619c(EsxV)黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答水平。方法PCR法扩增esxV基因克隆入原核表达载体pET28a(+),获得的重组E.coli诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定蛋白的表达,亲和层析法纯化EsxV蛋白。以EsxV和/或联合环二腺苷酸(c-di-AMP)经鼻黏膜免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠特异性抗体水平及亚类,MTS法检测脾细胞增殖,qRT-PCR检测脾和肺脏细胞因子表达水平,ELISA法检测脾细胞因子分泌水平。结果成功构建EsxV的原核表达载体pET28a(+)-esxV并诱导表达目的蛋白,亲和层析法获得了纯化的重组EsxV蛋白。EsxV经黏膜免疫可诱导显著的体液免疫应答,但诱导的细胞免疫应答水平不高。EsxV与c-di-AMP经黏膜接种可诱导特异性IgG水平增加,EsxV蛋白特异的脾细胞增殖,脾和肺细胞的IFN-γ转录增加。c-di-AMP显著提高EsxV特异的IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-17细胞因子分泌,而不诱导炎症因子TNF-α和IL-6表达。结论EsxV与c-di-AMP佐剂构建的亚单位疫苗可诱导特异性体液和细胞免疫应答,可进一步用于新型结核病亚单位疫苗的研制。

鼠疫耶尔森氏菌核酸疫苗的构建及其免疫学评价

目的获得鼠疫F1和V抗原的重组质粒pVAX1/F1和pVAX1/V,并比较其诱导的特异性免疫应答的能力。方法PCR扩增鼠疫菌F1和V编码基因,分别与pGEMT连接测序,构建pVAX1/F1和pVAX1/V重组质粒,转染COS7细胞。用细胞免疫化学方法鉴定目的蛋白的表达,重组质粒加GMCSF免疫Balb/c小鼠,观察免疫效果。结果F1和V均在COS7细胞中表达;免疫鼠体内产生特异性抗体,pVAX1/V所诱导的抗体水平比pVAX1/F1高;通过抗体亚型分析、细胞因子和CD分子等指标的测定表明所构建DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主。结论成功构建重组真核表达质粒pVAX1/F1和pVAX1/V,并且均具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,为鼠疫菌新型疫苗研制奠定了基础。

鼠疫亚单位疫苗研究进展

鼠疫 ,由于其强烈的传染性和极高的致死率 ,使得人们在应对它时 ,必须侧重于早期的防治。传统疫苗存在安全隐患 ,且存在效率低 ,接种反应率高以及不能保护人体免受肺鼠疫侵害等缺陷。近年来生物技术的迅速发展 ,为开展对鼠疫传统疫苗的改进和新疫苗的研究创造了条件 ,而这些研究当中 ,成果最为丰富的当属亚单位疫苗。目前鼠疫亚单位疫苗的研究大多围绕对鼠疫杆菌免疫原性起决定作用的两种主要抗原成分 (F1抗原和V抗原 )展开 。

大鼠骨髓增生异常综合征基因治疗及其机制研究

目的应用反基因V—erbB寡核苷酸（ODN）产品时大鼠骨髓增生异常综合征（MDS）动物模型进行基因治疗，观察其疗效和可能的毒性反应。方法尾静脉注射或口服治疗。对42只动物应用不同给药方法和剂量进仃治疗。（1）尾静脉注射给药，以常规剂量（D）0．56mg／kg和0．5×D两个剂量对17只大鼠MDS进行治疗。并以8只未经任何治疗的MDS为对照。在2～3个月的观察期，17只大鼠MDS均有骨髓原始和早幼粒细胞百分比（％）的下降，其中，94．1％（16／17）大鼠骨髓象恢复正常或接近正常；对照组8只MDS，3只从RA发展为RAEB，4只死于内脏出血，末见逆转为正常者。（2）口服用药14只动物，分别以1×D、0．5×D和0．25×D3种不同剂量。结果仅1×D有效，其余2种剂量均无效。（3）将反基因V—erbB寡核苷酸与CpG寡核苷酸联合应用，埘MDS、AEL和AML进行尾静脉注射治疗，发现此2种寡核苷酸治疗，显效时间明显缩短。但上述方案仅对MDS和AEL有效，而时AML则无效。（4）疗效原理研究证明，反基因V—erbBODN能抑制大鼠MDS中白血病的发展，而中心错配的反基因V—erbBODN和正基因V—erbBODN则不能。结论在0．56mg／kg剂量下，此产品对大鼠MDS，不论静脉注射或口服用约均有明显的疗效，且毒性不显。治疗恢复期间大鼠平均体重增加98g且生育能力完好，说明此产品具有临床应用价值；反基因V—erbB ODN通过形成巩固三链DNA结构，抑制内源性V—erbB表达和扩增，从而显示疗效。

拟态弧菌OmpU抗原表位的预测与多表位疫苗分子的设计

以拟态弧菌安徽分离株OmpU基因序列为基础,应用DNAStar Protean软件联合采用多种方法对OmpU的二级结构、柔性、亲水性、表面可能性和抗原指数等方面进行分析,预测OmpU的抗原表位,并以此设计多表位疫苗分子序列。结果表明,拟态弧菌OmpU至少含有9个B细胞表位,其中第24～31、56～66、93～111、123～129、183～198、253～258和275～287共7个区段的平均抗原指数较高。使用AAY接头以epitope5-epitope7-epitope2-epitope6-epitope3-epitope4-epitope1排列方式串联的多表位序列最接近原蛋白构象,各表位间相对独立,抗原性参数也较好,可作为研制多表位疫苗的候选分子序列。

鼠疫组分疫苗诱导小鼠体液免疫应答研究

目的通过检测鼠疫组分疫苗免疫小鼠诱导的体液免疫应答,对其免疫原性进行评价。方法将小鼠随机分成4个实验组,免疫后5周内眦采血,检测血清中抗F1抗原和rV抗原IgG及IgA抗体;充分暴露气管,沿气管上端剪一楔形口,用PBS冲洗肺泡制备肺冲洗液,检测肺冲洗液中抗F1抗原和rV抗原IgG及IgA抗体。结果血清中可产生较高效价的抗F1抗原和rV抗原IgG抗体以及较低效价的抗F1抗原IgA抗体。肺冲洗液中可检测到抗F1抗原和rV抗原的IgG抗体,但无特异性IgA产生。结论鼠疫组分疫苗能诱导小鼠产生较强的血清抗体应答,肺冲洗液可检测到一定的IgG抗体,该疫苗有希望成为我国新一代鼠疫疫苗。