人外周血Vα24 NKT细胞抗肿瘤免疫机制的初步研究

目的进一步认识Vα24 NKT细胞在抗肿瘤免疫中的作用。方法从正常人外周血中扩增并纯化得到Vα24 NKT细胞,通过流式细胞术检测其表型、活化后的细胞因子、细胞坏死相关因子的表达情况,采用DIOC18染色及流式细胞术测定Vα24 NKT细胞对肿瘤细胞的杀伤率,并利用不同的阻断剂进行阻断实验。结果Vα24 NKT细胞分泌高水平的IFN-γ和IL-4,并表达TNF-α、穿孔素(perforin)、FasL、TRAIL等细胞坏死相关因子。Vα24 NKT细胞对表面表达CD1d分子的肿瘤细胞株的杀伤率高于不表达CD1d分子的肿瘤细胞株,同时在α-GalCer存在时,Vα24 NKT细胞的杀伤活性增强。对Perforin、FasL、TNF-α、TRAIL进行阻断后,ConA对Vα24 NKT细胞的杀伤作用的阻断效果最为明显。结论Vα24 NKT对肿瘤的杀伤作用是CD1d分子限制性和抗原特异性的。Vα24 NKT通过穿孔素途径和TNF家族成员发挥其细胞毒作用,而穿孔素途径是其肿瘤杀伤的最主要途径。

慢性HBV感染者外周血Vα24 NKT细胞数量变化及其与肝脏损害程度的关系

目的:探讨慢性HBV感染者外周血Vα24自然杀伤T细胞(NKT)数量变化及其与肝脏损伤程度的关系.方法:观察对象为慢性乙型肝炎(CHB)患者26例、乙型肝炎后肝硬化患者(LC)9例、慢加急性肝衰竭患者(ACLF)8例和7名正常对照组(NC),入院后次日清晨取静脉全血2mL,裂解红细胞后,采用流式细胞仪检测外周血Vα24 NKT细胞数量占外周血T淋巴细胞的比例,同时检测肝功能、凝血功能判断肝脏损害程度.结果:CHB,ACLF组患者外周血Vα24 NKT细胞数量分别为0.8012%±0.2979%、0.4638%±0.2244%,明显低于正常对照组(1.1114%±0.3546%,P<0.05);CHB中度及重度患者NKT数(0.7344%±0.2441%,0.6925%±0.3612%)明显低于正常对照组.NKT数与凝血酶原活动度(PTA)呈显著正相关,与血清总胆红素(TB)呈显著负相关.结论:慢性HBV感染者外周血Vα24 NKT细胞数明显降低,并随肝损害程度加重而减少,提示Vα24NKT细胞可能参与CHB患者肝细胞损伤.

人外周血Vα24 NKT细胞和CD3^+CD56^+CIK细胞生物学特性的比较研究

目的进一步认识Vα24 NKT细胞和CIK细胞在生物学特性的差异。方法从人外周血单个核细胞扩增NKT细胞和CIK细胞;经免疫磁珠纯化获得高纯度的TCRVα24+NKT细胞和CD3+CD56+CIK细胞。运用流式细胞术测定纯化后的NKT细胞和CIK细胞的表型、细胞因子和细胞坏死相关因子的表达情况,并用DIOC18染色及流式细胞术测定纯化后的NKT细胞和CIK细胞的细胞杀伤活性。结果经纯化TCRVα24+Vβ11+NKT细胞和CD3+CD56+CIK细胞的纯度均达到>90%;纯化后的Vα24 NKT细胞多数为CD4+和DN NKT细胞,高表达TCRVα24、Vβ11、CD3、CD161,低表达CD56;而纯化后的CIK细胞则以CD8+T细胞为主,高表达CD3、CD56,低表达CD161,几乎不表达TCRVα24和Vβ11。在抗原刺激下,CD3+CD56+CIK细胞的IFN-γ、TNF-α、Perforin、FasL、TRAIL表达水平均高于NKT细胞,但CD3+CD56+CIK细胞几乎不分泌IL-4,而NKT细胞则分泌高水平的IL-4;CD3+CD56+CIK细胞对肿瘤细胞株K562、U937、Jurkat的杀伤率均远远高于NKT细胞。结论TCRVα24+NKT细胞和CD3+CD56+CIK细胞是两类完全不同的细胞群,在抗肿瘤免疫和免疫调节中可能起着不同的作用。

系统性红斑狼疮患者血中Vα24-Vβ11 NK T细胞介导的免疫调节失调机制研究

目的:通过对系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMC)中NK T细胞含量及其功能状态的研究,评价NK T细胞在这类疾病失调中的可能作用及其机制。方法:流式细胞光度术(FCM)检测NK T细胞含量;细胞培养检测NK T细胞增殖能力;ELISA检测细胞因子。结果:PBMC中NK T细胞含量比较:SLE组较正常对照组明显减少,具有极显著性差异。培养前后PBMC中NK T细胞含量比较,培养后较培养前均增加,具有极显著性差异。培养上清中IFN-γ含量比较:SLE组与正常对照组间比较无显著性差异。培养上清中IL-4含量比较:SLE组较正常对照组明显增加,具有极显著性差异。结论:SLE的发病可能与NK T细胞数量的低下及功能严重失调有关。

经α-半乳糖酰基鞘氨醇体外扩增Vα24自然杀伤T细胞的生物学特性

目的建立α-半乳糖酰基鞘氨醇(α-GalCer)诱导Vα24自然杀伤T(NKT)细胞体外扩增方法,评价其生物学特性。方法将26份脐带血或外周血标本分为3组:A1组(n=5):脐带血单个核细胞(MNC)在负载α-GalCer的脐带血前体细胞源性树突状细胞(DC)刺激下诱导扩增Vα24NKT细胞;A2组(n=5):外周血MNC在负载α-GalCer的外周血单核细胞来源DC(Mo-DC)刺激下诱导扩增Vα24NKT细胞;B组(n=16):在外周血MNC中直接添加α-GalCer,诱导扩增其中的Vα24NKT细胞。采用MTT法检测NKT细胞增殖能力、肿瘤细胞杀伤活性和混合淋巴细胞反应抑制能力,ELISA法测定IL-4和干扰素(IFN)-γ生成。结果A1、A2和B组NKT细胞扩增倍数分别为128(95～207)、250.5(179.6～790.6)和326(101～2136)倍,B组扩增效果明显优于A1组(P=0.038)。NKT细胞在佛波酯刺激下,3d刺激指数为1.80±0.41;脐血或外周血NKT细胞24h分泌IL-4/IFN-γ比值为0.30±0.13和0.28±0.18;能杀伤HL60、KG1a和Raji细胞,对K562细胞无效;NKT细胞及其培养上清均能抑制混合淋巴细胞反应。结论α-GalCer能在短期内大量扩增Vα24NKT细胞。扩增细胞能大量分泌IL-4和IFN-γ,杀伤肿瘤细胞系,并抑制T细胞同种免疫应答。

Vα24 NKT细胞的细胞因子生成调控

目的：评价细胞因子培养体系对经α-半乳糖酰基鞘氨醇（a-GalCer）体外扩增的NKT细胞的细胞因子生成的影响。方法：每份正常人外周血单个核细胞（MNC）标本分为3～4组：a[IL-2加IL-15，n=6]、b[IL2加IL-15加IL-12加γ干扰素（IFN-γ），n=6]、c[IL-2加IL-15加IL-7，n=6]、d[IL-2加IL-15加IL-7加粒细胞集落刺激因子（G-CSF），n=4]。培养中加入a-GalCer和相应细胞因子，12d后用流式细胞计数法测定NKT细胞及其亚群数量，并用细胞胞内染色法测定细胞因子生成。结果：①扩增的NKT细胞CD4^＋亚群中IL-4^＋细胞比例高于CD4^-亚群（P〈O．01）；2亚群中IFN-γ^＋。细胞比例相当（P〉O．05）。②各组NKT细胞中，b组IL-4^＋比例低于a组（P（0．01），C和d组均高于a组（均P（0．05），d和C组结果相当（P〉0．05）；而b组IFN-γ^＋比例略高于a组，但P〉0．05，d组低于a组（P〈0．05），C组与a组的结果相近（P〉0．05）。③各组CD4^＋NKT细胞亚群中，b组IL-4^-细胞比例低于a组（P〈0．01），C和d组高于a组（均P（0．01），而C和d组之间差异无统计学意义（P〉0．05）；各组CD4^-NKT细胞中，IL-4^＋细胞比例的差异无统计学意义（P〉0．05）；各组CD4^＋NKT细胞中，IFN-γ^＋细胞比例的差异无统计学意义（P〉0．05）；各组CD4^-NKT细胞中，IFN-γ^＋细胞比例的差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：不同细胞因子组合的培养体系，能调节经a-GalCer扩增的Va24NKT细胞IL-4和IFN-γ的生成，IL-7和G-CSF有助于IL-4的生成，而IL-12和IFN-γ有助于IFN-γ的生成。

不同来源人Vα24＋NKT细胞体外扩增及细胞因子分泌

为了研究人脐血(CB)、外周血(PB)及G-CSF动员后外周血采集物单个核细胞(G-PBMNC)中Vα24+NKT细胞的表型及体外扩增、细胞因子分泌情况,分别取来自CB和PB的单个核细胞(MNC)以及G-PBMNC,在含α-半乳糖酰基鞘胺醇(α-GalCer)及细胞因子IL-2、IL-15的体系中,体外扩增培养Vα24+NKT细胞;采用间标磁珠分选纯化NKT细胞;流式细胞术(FCM)检测NKT细胞表型、NKT细胞含量;酶联免疫吸附试验(ELISA)测定细胞因子IL-4、IFN-γ浓度。结果表明:由CB或PB或G-PBMNC诱导扩增Vα24+NKT细胞可分别扩增221.5倍、456.5倍、756.38倍。CB或PB来源的Vα24+NKT细胞经PMA刺激后,24小时生成IL-4、IFN-γ浓度和IL-4/IFN-γ比率分别为180.33vs190.67ng/ml、864.33vs508.49ng/ml、0.503vs0.455。由G-PBMNC诱导扩增Vα24+NKT细胞,培养9天及12天时生成IL-4、IFN-γ浓度及IL-4/IFN-γ比率分别为139.08vs89.3ng/ml、14264.8vs14488ng/ml、0.0531vs0.0376。结论:不同来源MNC在α-GalCer、IL-2、IL-15诱导下可以短期有效扩增Vα24+NKT细胞,G-PBMNC诱导扩增的效果优于CB和PB。NKT细胞活化后可以分泌大量IL-4及IFN-γ,但以IFN-γ为主。

晚期血吸虫病患者外周血中Vα24自然杀伤T细胞水平观察

目的:分析晚期血吸虫病患者外周血中Vα24自然杀伤T细胞水平。方法:选取笔者所在医院45例健康体检者设为对照组,45例晚期血吸虫病患者设为观察组。采用流式细胞术检测患者外周血细胞中的Vα24 NKT细胞在T淋巴细胞中的比例。检测两组肝功能指标,分析Vα24 NKT与肝功能的相关性。结果:观察组患者NKT细胞水平为(0.15±0.01)%,显著低于对照组的(0.84±0.21)%,差异有统计学意义(P<0.01)。两组各肝功能指标比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。相关性分析显示,NKT细胞在晚期血吸虫病患者外周血Vα24中与γ-GT呈正相关(r=0.371,P<0.05),而Vα24 NKT细胞与ALT、AST、ALP、TBIL、ALB、A/G无相关性(r=-0.001、-0.178、0.023、-0.101、0.026、0.031,P>0.05)。结论:晚期血吸虫患者外围血中Vα24 NKT细胞明显减少,Vα24 NKT细胞与γ-GT呈正相关,与ALT、AST、ALP、TBIL、ALB及A/G无相关性。

尖锐湿疣患者外周血Vα24^+天然杀伤T细胞数量与体外活化的研究

由于尖锐湿疣发病机制不清,目前尚无满意治疗方法.近几年研究发现,表达部分天然杀伤细胞受体和T细胞受体(TCR)Vα24片段的天然杀伤T(NKT)细胞在抗病毒及免疫调节中都发挥着重要作用[1].本研究采用流式细胞技术检测了不同病程尖锐湿疣患者外周血NKT细胞的数量及体外活化特性,以探讨NKT细胞在尖锐湿疣患者免疫应答中的作用.

系统性红斑狼疮患者外周血Vα24 Vβ11 NKT细胞的初步研究

目的研究系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血单个核细胞（PBMC）中Vα24 Vβ11 NKT细胞的数量以及经脂类物质α-半乳糖神经酰胺酶（α-Galeer）体外刺激后Vα24 Vβ11 NKT细胞的增殖情况。方法①运用流式细胞仪技术检NSLE患者外周血PBMC中Vα24 Vβ11 NKT细胞的表达；②在SLE患者PBMC体外培养体系中加入α-Galeer及白细胞介素（IL）-2，7d后观察Vα24 Vβ11 NKT细胞的增殖情况。结果SLE患者外周血PBMC中Vα24 Vβ11 NKT细胞数量减少（0.039±0.023）％低于正常对照组（0.200±0.060）％，差异有统计学意义（P〈0.05），经α-Galeer刺激后正常人Vα24 Vβ11 NKT细胞明显增殖（4.52±5.11）％，而SLE患者无增殖（0.06±0.11）％（P〈0.05）。结论SLE患者PBMC中Vα24 Vβ11 NKT数量下降且功能存在异常。

晚期血吸虫病患者外周血中Vα24自然杀伤T细胞水平观察

目的探讨晚期血吸虫病患者外周血中Vα24自然杀伤T细胞(NKT)水平及其与肝纤维化的关系。方法采用流式细胞术,检测41例晚期血吸虫病患者和48例健康体检者(对照组)外周血中的Vα24 NKT细胞占T淋巴细胞的比例;同时对晚期血吸虫病患者进行腹部超声检查,根据超声检查结果进行肝纤维化分级,比较各级间NKT细胞水平。结果 41例晚期血吸虫病患者的NKT细胞平均水平为(0.25±0.10)%,较健康对照组[(1.32±0.56)%]明显下降,差异有统计学意义(P<0.01)。晚期血吸虫病患者肝纤维化越严重,NKT细胞减少越明显,1级、2级、3级患者NKT细胞水平分别为(0.38±0.03)%、(0.29±0.04)%、(0.16±0.03)%,各级患者比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论晚期血吸虫病患者外周血中Vα24 NKT细胞水平明显下降,并随肝纤维化程度加重而减少,晚期血吸虫病患者发生及肝纤维化进展可能与Vα24 NKT细胞水平低下和/或功能缺陷有关。