V-ATPase与乳腺癌关系的研究进展

乳腺癌是当前女性发病率最高的恶性肿瘤,是女性癌症相关死亡的主要原因[1]。治疗方式主要包括内分泌治疗、抗HER2靶向治疗、放疗、化疗以及手术治疗等。乳腺癌的异质性取决于调节肿瘤发生和发展的复杂分子机制。因此,研究乳腺癌发生、发展的分子机制有助于发现新的诊断标志物和制定新的治疗策略。V-ATPase是一种多亚基酶,在人的生理和病理过程中发挥重要作用,与肿瘤细胞存活和侵袭有关[2]。大多数与癌症相关的死亡是原发性肿瘤转移所致。质膜上的V-ATPases能促进癌细胞侵袭和转移,此作用在人类乳腺癌模型中表现得尤为显著。本文概述V-ATPase可能的作用机制及其与乳腺癌关系的最新研究。

溶酶体V-ATPase调节肿瘤的pH稳态

癌细胞产生大量的细胞质质子,作为异常激活的有氧糖酵解和乳酸发酵的副产物。为了避免细胞内酸化的不利影响,癌细胞激活了促进胞内碱化和胞外酸化的质子清除途径。越来越多的证据表明,除了质膜中一些特殊的离子泵和转运蛋白外,癌细胞溶酶体为此发生重新编程。溶酶体膜上的液泡型H –三磷酸腺苷酶(V-ATPase)的表达和活性增加,且伴随溶酶体体积的增大,大大增加了溶酶体的质子存储能力,从而维持pH梯度逆转,促进癌细胞的生存和生长。本文主要对肿瘤细胞中的溶酶体V-ATPase的作用进行综述。

V-ATPase H表达量下调增强棉铃虫对Cry1Ac的抗性

棉铃虫Helicoverpa armigera是世界性重要农业害虫。目前防治棉铃虫的主要手段是种植转苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)杀虫蛋白的转基因作物。本文旨在研究棉铃虫V-ATPase H在Cry1Ac蛋白毒力和抗性中的作用。利用实时荧光定量qRT-PCR技术分析V-ATPase H在Cry1Ac抗、感品系棉铃虫幼虫中肠及敏感品系棉铃虫幼虫受Cry1Ac诱导后的表达情况;在昆虫Sf9细胞中过表达V-ATPase H对其进行细胞定位,通过细胞毒力试验验证其对Cry1Ac毒力的影响。结果发现棉铃虫V-ATPase H基因在抗性品系中低表达,并且V-ATPase H在受到Cry1Ac诱导时也低表达;在Sf9细胞内表达V-ATPase H蛋白发现其在整个细胞中都有分布,过表达该蛋白后增强了细胞对Cry1Ac蛋白的敏感性。结果表明V-ATPase H参与Cry1Ac蛋白的毒力。

桔小实蝇V-ATPaseG亚基基因的克隆及组织表达特异性分析

空泡型ATP酶(vacuolar-type H+-ATPase,V-ATPase)作为质子泵几乎在所有的真核生物细胞中发挥重要作用。本研究利用RT-PCR和RACE技术获得了桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)V-ATPase G亚基序列全长,命名为BdorATPG。测序结果表明,BdorATPG阅读框全长354bp,编码117个氨基酸。氨基酸序列比对表明,BdorATPG的N端序列与其他物种的ATPG亚基对应区域具有较高的序列一致性。BdorATPG与拟暗果蝇Drosophila pseudoobscura ATPG亚基的氨基酸序列一致性最高,为88.9%。三维结构模建结果表明,BdorATPG N端(第1～59位氨基酸)序列为α-螺旋结构,亲水性和疏水性氨基酸在螺旋两侧呈对称分布。BdorATPG在不同组织中的荧光定量PCR分析表明,BdorATPG在各组织中都有表达,其中在触角中的表达量最高;在雄虫生殖节中的表达量是雌虫中的6.04倍。结果提示BdorATPG可能在雄虫生殖生理过程中发挥重要作用。

上皮性卵巢癌中V-ATPase与Ki-67的表达及其临床意义

目的探讨液泡膜-ATP酶(V-ATPase)及Ki-67在上皮性卵巢癌(EOC)的表达、临床意义及二者的相关性。方法免疫组织化学染色法检测EOC及正常卵巢上皮组织中VATPase及Ki-67蛋白的表达,分析两者相关性及V-ATPase与EOC临床病理特征、肿瘤发展的关系。结果 V-ATPase蛋白在EOC组织阳性表达率与正常卵巢上皮细胞组织阳性表达率相比(61. 3%vs 12. 5%),差异有统计学意义(P <0. 05)。V-ATPase表达与EOC患者的年龄、病理类型、脉管浸润无明显相关性(P> 0. 05),而与卵巢癌FIGO分期(P=0. 002)、病理分级(P=0. 001)、淋巴结转移(P=0. 020)以及肿瘤大小(P=0. 015)有明显相关性(P <0. 05)。且在EOC中,V-ATPase和Ki-67阳性表达呈正相关性(rs=0. 238,P<0. 05)。结论 V-ATPase在EOC组织中高表达。V-ATPase和Ki-67可能共同参与EOC肿瘤的发生发展,二者结合检测有可能对卵巢恶性肿瘤的临床诊断和治疗有一定价值。

马蔺V-ATPase c亚基基因家族的克隆及序列分析

植物V-ATPase在逆境条件下的应答功能对保证细胞的正常生命活动具有重要作用。本研究根据GenBank收录的外源V-ATPase c亚基,设计简并引物,以马蔺为材料,通过RT-PCR进行扩增,经测序该片段为471bp,包含V-ATPase基因家族的保守结构域,以该片段为靶序列进行5′-RACE延伸,将产物测序得到186bp的序列,将靶序列与5′-RACE产物进行拼接,根据拼接结果设计特异引物,克隆基因全长读码框。结果表明,得到马蔺VHA-c亚基家族的5个成员,片段全长632bp,包括137bp5′-UTR,开放读码框全长495bp,编码164个氨基酸,分子量约为16kDa,包含4个跨膜结构域。将该基因命名为IrlVHA-c1～c5。

玉米V-ATPase B亚基基因(ZmVHA-B)的克隆及其表达分析

根据玉米基因组数据MaizeGDB(http://www.maizegdb.org/)已经公布的玉米VHA-B(V-ATPase subunit B)基因的mRNA序列(AY104180),从干旱处理玉米材料CN165的花丝中利用RT-PCR技术获得VHA-B基因的编码序列,并进行了序列分析和Northern杂交分析。结果表明:VHA-B基因编码487个氨基酸,含有1个保守的ATP结合位点,其编码的蛋白分子量为54.09kD,等电点为4.99。氨基酸同源性分析表明:V-ATPase B亚基是一个较为保守的蛋白亚基。Northern杂交结果表明:在干旱处理下,B亚基存在两个不同的转录本,它们对干旱的响应不同;在盐胁迫下,同样也存在两个转录本,它们都对盐胁迫做出了响应;在冷处理下,仅存在1个转录本,且它的表达较强,仅仅在6h有一些微小地反复;在ABA处理下,也仅存在1个转录本,处理1h后表达明显上调,此后一直保持较高的表达水平。玉米VHA-B基因对花期干旱有响应,但在花丝和雌穗中的表达响应方式不同,在花丝中干旱诱导表达明显,而在雌穗中存在表达没有明显差异的两个转录本。

V-ATPase:结构、功能及其在肿瘤细胞中的作用

真核细胞膜及管泡细胞器膜上广泛分布一种与H+主动转运有关的蛋白——V-ATPase。V-AT-Pase的结构由跨膜的V0和细胞质内的V1两个亚单位组成,前者为H+提供通道,后者能分解ATP,为逆浓度梯度转运H+提供能量。V0和V1只有在聚合时,V-ATPase全酶才有功能。肿瘤细胞中V-ATPase的过度表达或过度活跃,遏制了由酵解增强乳酸聚集导致的细胞内酸化趋势,使细胞避免了凋亡的命运。而H+排至细胞外,改变蛋白水解酶的活性,使细胞外基质分解增强,细胞更有侵袭力。肿瘤细胞的V-ATPase可望成为抑制细胞增生、扩散的有效靶点。

过表达ThVHAc1对拟南芥V-ATPase各亚基表达的影响

V-ATPase是多亚基复合蛋白,其c亚基负责V-ATPase的组装及质子通道的形成。本研究拟分析盐胁迫下过表达Th VHAc1基因拟南芥V-ATPase各亚基的表达,探讨过表达外源c亚基对拟南芥V-ATPase全酶响应盐胁迫表达模式的影响。实时荧光定量PCR结果显示,盐胁迫下,过表达外源Th VHAc1拟南芥V-ATPase 28个亚基的表达发生了明显改变,且拟南芥5个c亚基的表达均不同程度的被抑制。表明外源Th VHAc1基因能影响拟南芥V-ATPase各亚基的表达以调节V-ATPase全酶的活性,但各亚基的表达模式与V-ATPase活性非简单对应关系,各亚基互相协调决定V-ATPase活性。

ABCG4和V-ATPase在非小细胞肺癌中的表达及相关性临床意义

背景与目的多药耐药是肺癌化疗治疗失败的重要原因,ABC介导药物外排是耐药的主要因素,寻找该家族中新的耐药蛋白并阐明其耐药机制十分重要。ABCG4有望成为耐药候选基因;耐药性与细胞内外pH值可能有关,而V-ATPase在调节pH值起主要作用。本研究通过检测ABCG4和V-ATPase在非小细胞肺癌中的表达,分析其与病理分级和TNM分期间的关系以及两蛋白表达的相关性,为研究ABCG4、V-ATPase在肿瘤表达及耐药相关性提供基础。方法采用免疫组化EnVinsion法、免疫荧光法检测在肺鳞癌、腺癌中的表达,激光共聚焦显微镜观察其定位和共定位,用统计学分析表达差异性和相关性。结果ABCG4在肺鳞癌、腺癌中高表达,两者差异性显著(P=0.001);鳞癌Ⅱ和Ⅱ-Ⅲ组间、腺癌不同分化组间差异性显著;鳞癌和腺癌TNM分期秩和检验差异性显著。V-ATPase在鳞癌、腺癌中也为高表达,两者差异性非常显著;鳞癌Ⅱ和Ⅱ-Ⅲ组间、腺癌不同分化组间差异性显著;在鳞癌和腺癌TNM分期秩和检验差异性均不显著。ABCG4和V-ATPase蛋白在鳞癌、腺癌、鳞癌Ⅱ和Ⅱ-Ⅲ、中分化腺癌各组中的表达相关性检验P<0.01,相关系数rs分别为0.771、0.765、0.714、0.777、0.865;而低分化腺癌组中的相关性检验P值为0.048,相关系数rs为0.350。ABCG4主要定位在胞膜上和胞质中,两蛋白有共定位现象。结论ABCG4和V-ATPase在非小细胞肺癌中高表达,表达的高低与病理分级、TNM分期有关;两蛋白在鳞癌、腺癌及其分级间表达都存在相关性,可能存在相互作用的现象。这为研究ABCG4和V-ATPase在肿瘤中的表达及可能耐药作用提供了实验依据。

V-ATPase分子结构与功能及其RNAi技术在害虫防治中的应用研究进展

V-ATPase广泛分布在原核和真核细胞内膜系统,作为ATP驱动质子泵调控细胞各种生理过程。系统阐述了V-ATPase V1结构域和V0结构域中各亚基(A、B、C、D、E、F、G、H、a、c、c′、c″、d、e)的分子结构和功能,以及V-ATPase相关亚基作为靶标进行RNAi的相关研究,为实现害虫防控、延缓害虫抗药性产生提供了新的思路和方法。

V-ATPase在肝细胞癌中的表达及其与浸润转移的关系

目的研究V-ATPase在肝癌组织的表达及其与肝癌浸润转移的关系。方法用RT-PCR和免疫组织化学方法检测肝癌组织中V-ATPase mRNA和蛋白的表达。用癌细胞体外迁移实验观察培养基中加入V-ATPase抑制剂Bafilomycin A1后细胞迁移能力的改变。结果肝癌组织V-ATPase mRNA和蛋白的表达明显强于癌旁组织和正常肝组织。加入Bafilomycin A1后肝癌细胞迁移能力减弱。结论 V-ATPase在肝癌组织高表达并与转移有关,Bafilomycin A1抑制V-ATPase,干扰癌细胞内H+的泵出,削弱癌细胞的迁移能力。

V-ATPase与耳聋相关的研究进展

耳聋是影响人类健康和造成人类残疾的常见原因。造成耳聋的原因是多方面的。但是大致可以归为环境因素和遗传因素两大类，遗传因素为主要因素。先天性耳聋的发病率约为1／1000（新生儿）。在我国，每年有30000个患有先天性听力损害的婴儿出生。遗传性耳聋根据是否伴有耳外组织的异常或病变可分为综合征性耳聋（syndromie bearing loss,SHE）和非综合征性耳聋（nonsyndromic heatingloss，NSHL）。在发达国家的语前聋患者中，至少2／3的患者是遗传性耳聋。在遗传性耳聋患者中，NSHL约占70％，SHL约占30％。

枇杷果实液泡膜V-ATPase D亚基基因的克隆及表达

提取枇杷果实总RNA,根据RNAseq数据库查找得到的(液泡膜质子泵V-ATPase)基因片段序列11个。设计引物,采用RACE技术,获得质子泵V-ATPase cDNA的全长,对测序结果进行分析,并将序列在NCBI上进行blast比对,结果显示核苷酸序列和氨基酸同源性均在80%以上,为质子泵酶基因V-ATPase D亚基基因。经qPCR分析表明,该基因对枇杷果实有机酸具有明显调控作用。

基于V-ATPase a3转运蛋白探讨骨质疏松症的分子机制

目的存在于破骨细胞的皱褶缘上的V-ATPase a3转运蛋白在骨质疏松症的骨吸收中发挥着重要作用。V-ATPase a3转运蛋白将H+逆浓度梯度转运到密闭区,溶解无机矿物质,为水解酶如CAⅡ、CATK、MMPs等提供酸性环境,抑制V-ATPase a3转运蛋白已成为治疗骨质疏松症的新靶标;并深化对CAⅡ、CATK、MMPs等水解酶阻滞剂的认识,从而多渠道、多方位、多靶点地拓展骨质疏松症的治疗。

玉米根V-ATPase的A亚基磷酸化位点的鉴定

以玉米(ZeamaysL.)根的高纯度液泡膜为材料进行的磷酸化反应表明，液泡膜蛋白的磷酸化可明显提高V型H^+-ATPase(V-ATPase)的ATP水解活性和H^+转运活性。进一步研究表明，纯化的液泡膜蛋白能被硫代磷酸化，用V-ATPase的A亚基抗体将一条约69kD的条带鉴定为A亚基。为了测定V-ATPase的A亚基的磷酸化位点，从硫代磷酸化的凝胶中切下A亚基条带并用胰蛋白酶彻底消化。用RP-HPLC分离纯化酶解片断，收集纯化的硫代磷酸化肽段进行质谱分析所测定的分子量为573．83Da。A亚基胰蛋白酶彻底消化后能产生61个肽段，只有F56肽段的分子量573．66Da与573．83Da最接近，而且F56肽段上只有第525位的丝氨酸可以被磷酸化。因此可以确定，玉米根V-ATPaseA亚基的潜在磷酸化位点为Ser525。就我们所知，这是首次确定植物V-ATPaseA亚基的磷酸化位点。

白念珠菌V-ATPase研究进展

白念珠菌是临床最常见的条件致病真菌,V-ATPase是真核生物中高度保守的质子泵转运复合物,可以维持液泡和细胞质pH稳态。近年来,V-ATPase作为一个抗白念珠菌感染的潜在靶点为人们所关注,本文就V-ATPase抑制剂、相关的其他靶点及抑制剂筛选等方面的研究进展作一综述。

V-ATPase与肿瘤转移

恶性肿瘤的高转移性是危及患者生存及影响治疗效果的最主要因素。原发灶癌细胞的脱离及迁移在肿瘤中发挥重大作用,肿瘤细胞转移需要分泌一些生物大分子(如金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶等)到胞外协助降解基质。这些分子发挥作用依赖于低pH的微环境。研究发现(VacuolarATPase简称V-ATPase)在肿瘤组织的酸化过程中起重要作用。本文对V-ATPase的结构及其在肿瘤细胞中的作用作一综述。

棉铃虫V-ATPase亚基B是Cry1Ac的功能受体

目前对转苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)的研究发现,液泡型ATP酶(Vacuolar-type proton ATPase,V-ATPase)可能是Bt的一类新型受体。我们前期通过构建棉铃虫的中肠酵母文库筛选Cry1Ac的结合蛋白发现棉铃虫V-ATPase亚基B(V-ATPase B)可以与Cry1Ac结合。为明确V-ATPase B在Cry1Ac毒力和昆虫对Cry1Ac抗性机制中的作用,本研究首先采用实时荧光定量PCR技术分析了该基因在抗感Cry1Ac棉铃虫幼虫中及其受到Cry1Ac诱导时的基因表达情况;通过Ligandblot进一步地证实了其与Cry1Ac的结合特性;并通过在Sf9细胞中表达V-ATPase B的试验验证了其功能。结果表明V-ATPase B在抗性品系及受到Cry1Ac诱导时均下调表达,Ligand blot证实了V-ATPase B与Cry1Ac特异性结合;并且在昆虫细胞内过表达该基因,会增强Cry1Ac的细胞毒力。研究结果表明棉铃虫V-ATPase B是Cry1Ac的功能受体,并有可能通过降低基因表达来参与棉铃虫对Cry1Ac的抗性形成。

东方粘虫中肠V-ATPase H亚基原核表达及纯化

对东方粘虫Mythimna separate(Walker)中肠V-ATPase H亚基基因(VATPH)进行克隆、原核表达及纯化。首先采用RT-PCR技术克隆基因,再构建原核表达载体(pET15b-VATPH)并转入E.coil BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,用Ni-NTA柱及S-200分子筛纯化,最后进行SDS-PAGE分析。结果表明,pET15b-VATPH可高效表达V-ATPase H亚基,纯化后可获得单一条带且分子质量约为55ku的重组蛋白。该结果为进一步研究V-ATPase H亚基的晶体结构,药物小分子与H亚基大分子的相互作用,尤其是以H亚基为筛选模型创制新农药奠定基础。