基于VEGFA/TNF/IL-6信号通路探讨灵泽片对良性前列腺增生大鼠的治疗作用

目的:基于VEGFA/TNF/IL-6通路探讨灵泽片对良性前列腺增生大鼠的干预机制。方法:将30只SPF级SD大鼠随机等分为空白对照组、模型对照组、灵泽片低剂量组、灵泽片中剂量组、灵泽片高剂量组。除空白对照组外,余各组大鼠采用非去势丙酸睾酮诱导法建立前列腺增生大鼠模型。造模结束后,空白对照组及模型对照组选用生理盐水,灵泽片低、中、高剂量组分别选用相应药物,连续灌胃给药28 d。灌胃结束后处死大鼠,取前列腺组织,观察各组大鼠前列腺指数、组织结构及VEGFA/TNF/IL-6信号通路相关蛋白的变化。结果:与空白对照组比较,模型对照组大鼠前列腺组织增生明显;前列腺指数明显上升(0.84±0.01,P<0.05),组织学观察形态可见前列腺上皮组织厚度扩大和管腔区浸润现象,VEGFA(0.60±0.02,P<0.05)、TNF(0.76±0.02,P<0.05)、IL-6(0.64±0.02,P<0.05)蛋白表达水平显著上升,差异具有统计学意义。与模型对照组比较,灵泽片低剂量组(0.76±0.02,P<0.05)、中剂量组(0.58±0.02,P<0.05)、高剂量组(0.52±0.01,P<0.05)大鼠前列腺指数均有所下降,差异有统计学意义;组织形态可见显著改善,WB结果显示灵泽片干预各组的VEGFA蛋白(低剂量组:0.45±0.01,中剂量组:0.35±0.01,高剂量组:0.31±0.02,各组P均<0.05)、TNF蛋白(低剂量组:0.45±0.01,中剂量组:0.33±0.01,高剂量组:0.27±0.01,各组P均<0.01)、IL-6蛋白(低剂量组:0.44±0.01,中剂量组:0.36±0.01,高剂量组:0.30±0.01,各组P均<0.01)表达水平均有所下降,差异有统计学意义,且改善情况与灵泽片剂量呈正比。结论:灵泽片可能通过负向调控VEGFA/TNF/IL-6信号通路,下调VEGFA/TNF/IL-6蛋白表达水平,调控细胞增殖与凋亡,调节炎症反应,从而发挥对BPH的治疗作用。

紫癜肾煎剂对过敏性紫癜性肾炎大鼠PI3K/AKT及HIF-1α/VEGFA信号通路的影响

目的 观察紫癜肾煎剂对过敏性紫癜性肾炎(Henoch Schonlein purpura nephritis, HSPN)模型大鼠的治疗作用,并基于PI3K/AKT和HIF-1α/VEGFA信号通路探讨其作用机制。方法 随机选7只SD大鼠分为正常对照组,其余大鼠应用“BSA+LPS+CCL4”联合干姜建立HSPN大鼠模型,12周后随机抽取正常对照组和造模组的大鼠各1只,取肾组织固定包埋,采用免疫荧光检测造模组大鼠肾组织中IgA沉积并伴有蛋白尿,正常组无上述表现,提示造模成功。将造模成功的HSPN大鼠模型随机分模型组、紫癜肾煎剂低、高剂量(6.10、24.40 g/kg)组和西药(3.93 mg/kg)组,每组6只。给药结束后,采用溴甲酚紫法测定尿蛋白浓度,计算24 h尿蛋白定量;各组大鼠肾组织病理和免疫荧光检测;采用Western blotting法检测SD大鼠肾组织PI3K、AKT、HIF-1α、VEGFA蛋白表达情况。结果 紫癜肾煎剂可以显著降低24 h尿蛋白(P<0.05),减少肾小球系膜区免疫复合物沉积;与模型组比较,中药方组和西药组大鼠肾组织PI3K、AKT、HIF-1α、VEGFA蛋白表达明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 紫癜肾煎剂能减少HSPN大鼠24 h蛋白尿,改善肾功能及肾组织病理损伤,延缓HSPN病情进展,其机制可能与调控PI3K/AKT和HIF-1α/VEGFA信号通路有关。

腰椎间盘突出伴坐骨神经痛患者血清HIF-1α、VEGFA水平与痛阈值关系及交互作用

目的探讨腰椎间盘突出伴坐骨神经痛(LDHS)患者血清缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子A(VEGFA)水平与痛阈值的关系及交互作用。方法选取2020年5月至2023年2月在本院就诊的126例LDHS患者作为病例组,另选取同期126例体检健康者作为对照组。比较两组血清HIF-1α、VEGFA水平、痛阈值,Pearson相关系数分析血清HIF-1α、VEGFA水平与痛阈值的关系,多元线性回归分析血清HIF-1α、VEGFA水平与LDHS患者痛阈值的关系及交互作用。结果病例组血清HIF-1α、VEGFA水平高于对照组,痛阈值低于对照组(P<0.05)。病例组血清HIF-1α(r=0.777,P<0.001)、VEGFA(r=0.822,P<0.001)水平与痛阈值呈中度正相关,对照组血清HIF-1α(r=0.383,P<0.001)、VEGFA(r=0.453,P<0.001)水平与痛阈值无明显相关性。不考虑交互作用,血清HIF-1α、VEGFA水平与痛阈值存在线性相关(P<0.05),拟合方程为Y=-0.409+0.004×HIF-1α+0.019×VEGFA,所有预测变量可解释因变量的74.3%的方差。考虑交互作用,痛阈值的拟合方程为Y=19.276+0.062×HIF-1α+0.047×VEGFA-0×HIF-1α×VEGFA,所有预测变量可解释因变量的74.7%的方差,VEGFA低表达时,HIF-1α表达与痛阈值的关系较强,当VEGFA高表达时,HIF-1α与痛阈值的关系减弱,直线趋于平缓。结论血清HIF-1α、VEGFA水平与LDHS患者痛阈值关系密切,在对痛阈值影响中具有交互作用。

大黄素抑制背根神经节压迫小鼠模型STAT3、VEGFA、p-ERK蛋白表达及其镇痛作用研究

目的 研究大黄素(Emodin,ED)对背根节压迫小鼠模型的镇痛作用以及对STAT3/VEGFA/p-ERK信号通路的影响。方法 建立背根神经节慢性压迫(chronic compression damage,CCD)小鼠疼痛模型,随机分为空白组、模型组、普瑞巴林组及ED低、中、高剂量组。通过检测动物机械痛敏和热辐射痛敏阈值、醋酸扭体实验评价镇痛效果;ELISA检测小鼠L4-L5节段脊髓组织中白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和CD18等炎症因子含量;Western blot和免疫荧光检测脊髓组织信号转导子和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和磷酸化细胞外信号调节激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinases 1/2,p-ERK1/2)蛋白表达。结果 与空白组比较,模型组的机械痛敏、热辐射痛敏阈值显著降低(P<0.05),脊髓背角炎症因子表达显著增高(P<0.05),脊髓中VEGFA、STAT3、p-ERK的表达显著上调(P<0.05)。与模型组比,ED低、中、高剂量组CCD小鼠模型的机械痛敏、热辐射痛敏阈值升高(P<0.05);脊髓背角炎症因子表达降低(P<0.05);脊髓背角小胶质细胞STAT3、VEGFA、p-ERK的表达降低(P<0.05),醋酸诱导的小鼠急性疼痛中扭体次数减少(P<0.05)。结论 ED对背根节压迫小鼠模型有良好的镇痛作用,其机制可能与抑制脊髓背角炎症因子表达和STAT3/VEGFA/p-ERK介导的脊髓小胶质细胞活化有关。

HAX1及VEGFA表达与脑胶质瘤预后的相关性及临床价值

目的探讨造血细胞特异蛋白1相关蛋白X1(hematopoietic cell specific protein 1-associated protein X1,HAX1)和血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)在脑胶质瘤中的表达及相关性,以及与患者术后生存时间、预后的关系。方法UALCAN数据库分析多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)组织中HAX1及VEGFA mRNA的表达水平;GEPIA数据库分析GBM组织中HAX1与VEGFA表达的相关性;qRT-PCR法检测30例脑胶质瘤及12例正常脑组织中HAX1及VEGFA mRNA的表达;组织芯片结合免疫组化法检测214例脑胶质瘤组织及86例正常脑组织中HAX1和VEGFA蛋白表达水平,分析两种蛋白表达的相关性及两者与脑胶质瘤临床病理特征及患者预后的关系;GEPIA数据库进一步分析两者表达与胶质瘤患者预后的相关性。结果数据库分析结果显示,HAX1和VEGFA mRNA在GBM组织中均高表达(P=3.874100E-02,P=1.62436730732907E-12),且两者在脑胶质瘤中表达呈正相关(r=0.14,P=0.00039);qRT-PCR结果显示,HAX1(1.66±0.40)和VEGFA(2.75±0.73)mRNA在脑胶质瘤组织中均高表达(t=4.744,P<0.0001;t=8.263,P<0.0001);免疫组化结果显示,与正常脑组织相比,HAX1(67.8%,145/214)和VEGFA(72.0%,154/214)蛋白在脑胶质瘤组织中的阳性率更高(χ^(2)=29.174,P<0.05;χ^(2)=33.477,P<0.05),且两者表达呈正相关(r=0.593,P<0.05);HAX1和VEGFA蛋白表达均与行为状态评分(karnofsky performance status,KPS)、组织分化程度、WHO分级、p53及Ki-67蛋白表达密切相关(P<0.05);生存分析显示,HAX1阳性及VEGFA阳性患者的总生存率(5.5%、6.5%)明显低于HAX1阴性患者(62.3%、68.3%)(P<0.001),且两者均阳性的患者总生存率(4.6%)更低(P<0.001);预后分析显示,HAX1蛋白阳性(HR=1.746,P=0.026)、VEGFA蛋白阳性(HR=2.760,P<0.001)、组织中+低分化(HR=3.097,P=0.034)、WHO高分级(HR=1.533,P=0.005)及Ki-67蛋白阳性(HR=1.827,P=0.011)是患者预后的独立危险因素。GEPIA数据库分析结果亦显示,HAX1(HR=1.4,P=0.004)与VEGFA(HR=4.2,P<0.01)表达与患者生存呈负相关。结论HAX1和VEGFA在脑胶质瘤中高表达,其参与了脑胶质瘤的恶性生物学进展,并影响患者预后。

血府逐瘀胶囊联合顺铂对小鼠Lewis肺癌移植瘤血管新生及VEGFA、VEGFR2表达的影响

目的探讨血府逐瘀胶囊联合顺铂对小鼠Lewis肺癌移植瘤血管新生及血管内皮生长因子A(VEGFA)、血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)表达的影响。方法从75只C57BL/6小鼠中随机取15只作为正常组,其余小鼠均进行Lewis肺癌荷瘤造模。将造模成功的60只小鼠随机分为模型组、顺铂组、血府逐瘀胶囊组、血府逐瘀胶囊联合顺铂组,每组15只。血府逐瘀胶囊组给予血府逐瘀胶囊0.36 g/kg灌胃,模型组给予生理盐水灌胃,均2次/d;顺铂组给予2 mg/kg的顺铂腹腔注射,2 d 1次;血府逐瘀胶囊联合顺铂组给予0.36 g/kg血府逐瘀胶囊灌胃(2次/d)和2 mg/kg的顺铂腹腔注射(2 d 1次);正常组不给予任何干预。各组连续干预15 d后,统计存活率,摘取瘤组织并称量瘤重,计算抑瘤率,免疫组化法检测肿瘤组织中微血管数量,ELISA法测定血浆VEGFA、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)水平,免疫印迹法检测肿瘤组织中VEGFA、VEGFR2蛋白表达情况。结果顺铂组和血府逐瘀胶囊联合顺铂组小鼠存活率明显高于模型组和血府逐瘀胶囊组(P均<0.05);血府逐瘀胶囊联合顺铂组瘤重明显低于其他组(P均<0.05),抑瘤率明显高于顺铂组和血府逐瘀胶囊组(P均<0.05),肿瘤组织中微血管数明显少于模型组和血府逐瘀胶囊组(P均<0.05);顺铂组瘤重明显低于模型组和血府逐瘀胶囊组(P均<0.05),抑瘤率明显高于血府逐瘀胶囊组(P<0.05),肿瘤组织中微血管数明显少于其他组(P均<0.05)。顺铂组血浆VEGFA、bFGF水平和肿瘤组织中VEGFA、VEGFR2蛋白相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05);血府逐瘀胶囊联合顺铂组血浆bFGF水平和肿瘤组织中VEGFR2蛋白相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05)。结论血府逐瘀胶囊联合顺铂对Lewis肺癌荷瘤小鼠具有显著的抑瘤及抑制肿瘤血管新生的作用,其机制可能与VEGFA/VEGFR2信号通路相关。

血清TLR4和VEGFA表达对糖尿病视网膜病变的临床诊断及预后价值评估

目的:探讨Toll样受体4(TLR4)、血管内皮生长因子A(VEGFA)在糖尿病视网膜病变(DR)患者血清中的表达情况及临床意义。方法:选取2021-01/2022-01本院收治的183例2型糖尿病(T2DM)患者为研究对象,分为非糖尿病视网膜病变(NDR)组(54例),增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)组(68例)和非增殖性糖尿病视网膜病变(NPDR)组(61例)。同期按照年龄、性别分层随机选择70例于本院进行健康体检志愿者作为对照组。出院后随访1a,根据DR患者是否发生视力残疾,分为预后不良组(40例)与预后良好组(89例)。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中TLR4、VEGFA水平;通过Logistic回归分析DR发生的影响因素;利用受试者工作特征曲线(ROC)分析血清TLR4、VEGFA水平诊断DR及预测预后的临床价值。结果:对照组、NDR组、PDR组和NPDR组间TLR4、VEGFA水平比较均具有差异(F=935.753、516.936,均P<0.05),各组两两比较均具有差异(P<0.05)。预后不良组患者血清中TLR4、VEGFA表达水平均高于预后良好组(P<0.01)。Logistic回归分析结果显示,TLR4、VEGFA、病程、HbA1c均是DR发生的危险因素(P<0.05);ROC结果显示,血清TLR4、VEGFA水平及二者联合预测DR的AUC分别为0.869、0.862、0.931,血清TLR4、VEGFA水平及二者联合预测DR患者视力残疾的AUC分别为0.864、0.863、0.938。结论:DR患者血清中TLR4、VEGFA表达均上调,二者联合检测可作为评估DR发生及预后不良的潜在指标。

促血管和血管拟态生成因子VEGFA、MMP-14在肺腺癌中的表达及临床意义

目的探讨经典血管内皮生长因子A(VEGFA)和促血管拟态生成因子基质金属蛋白酶14(MMP-14)在肺腺癌中表达及临床意义。方法采用TCGA和UALCAN数据库分析肺腺癌MMP-14和VEGFA基因及蛋白表达水平及其与生存预后的相关性。收集69例肺腺癌患者及20例健康受试者(对照组)血清,分别采用ELISA和化学发光法检测MMP-14和VEGFA含量,分析二者与肿瘤临床病理学特征相关性及对肺腺癌的预测、诊断价值。结果肺腺癌组织和血清中MMP-14和VEGFA水平均高于对照组。肺腺癌早期组、晚期组和对照组血清VEGFA和MMP-14表达水平差异均有统计学意义(P<0.001)。MMP-14在T3/T4期高于T1/T2分期(P=0.045),N2/N3期高于N0/N1期(P=0.035),胸膜转移组高于未转移组(P=0.034)。VEGFA在M1期高于M0期(P=0.025)。VEGFA水平升高为肺腺癌的危险因素(P=0.002)。MMP-14、VEGFA和癌胚抗原(CEA)单项诊断肺腺癌的曲线下面积(AUC)分别为0.793、0.849、0.851,三项联合检测AUC为0.952。MMP-14、VEGFA低表达组的总生存期(OS)和疾病特异生存期(DSS)均长于MMP-14、VEGFA高表达组。结论MMP-14和VEGFA在肺腺癌中高表达,分别与肺腺癌的生长、侵袭和转移有关,并对生存预后判断有一定意义。

牦牛VEGFA双荧光素酶载体构建及与miR-200b的靶向验证

为探究微小RNA(miR-200b)与血管内皮生长因子A(VEGFA)基因之间的靶向关系,采用miRanda和Targetscan软件预测牦牛miR-200b与VEGFA可能存在结合位点,构建了VEGFA基因3′UTR区的野生型和突变型双荧光素酶载体。利用与目的miRNA靶种子序列相结合基因的突变序列,构建该靶基因的突变型重组质粒(pGL3-promoter-mut VEGFA),再进行重组质粒和目的miRNA的miRNA mimic的共转染实验。结果表明,预测到的miR-200b与VEGFA基因的3′UTR区存在结合位点。PCR进行扩增和测序之后,VEGFA基因3′UTR区的野生型、突变型载体构建成功。共转染VEGFA野生型载体和miR-200b mimic的双荧光素酶活性极显著低于对照组(P<0.05),VEGFA突变型载体和miR-200b mimic共转染的双荧光素酶活性与对照组无显著差异(P>0.05)。说明VEGFA基因的3′UTR区能与miR-200b结合并抑制双荧光素酶活性,验证了VEGFA是miR-200b的靶基因。

CXCL13联合VEGFA过表达抑制荷黑素瘤和结肠癌小鼠的肿瘤生长

目的探究CXC趋化因子配体13(CXCL13)与血管内皮生长因子A(VEGFA)对肿瘤生长的影响。方法通过慢病毒包装及感染技术,构建稳定过表达CXCL13、VEGFA、CXCL13联合VEGFA的B16小鼠黑素瘤细胞和MC38小鼠结肠癌细胞。采用CCK⁃8、5⁃乙炔基⁃2′⁃脱氧尿苷(EdU)法、集落形成实验检测过表达后肿瘤的体外增殖能力。建立过表达CXCL13、VEGFA细胞的小鼠皮下荷瘤模型探索对体内肿瘤生长的影响。结果与对照组相比,体外单独过表达CXCL13、单独过表达VEGFA和联合过表达CXCL13和VEGFA对B16和MC38细胞增殖无明显影响。体内单独过表达CXCL13和单独过表达VEGFA对黑素瘤的生长无明显影响,而联合过表达CXCL13和VEGFA显著抑制黑素瘤的生长;在MC38结肠癌模型中,单独过表达CXCL13组和单独过表达VEGFA组的肿瘤体积和质量显著高于对照组,而联合过表达CXCL13和VEGFA组的肿瘤体积和体质量较单独过表达组显著减小。结论CXCL13联合VEGFA过表达抑制荷黑素瘤和结肠癌小鼠的肿瘤生长。

miR-199-3p通过靶向VegfA抑制大鼠糖尿病视网膜病变

目的探究miR-199-3p在糖尿病视网膜病变(DR)中的作用及其机制。方法单次注射链脲佐菌素建立大鼠糖尿病模型,RT-qPCR检测大鼠视网膜组织miR-199-3p、血管内皮生长因子A(VEGFA)表达;双荧光素实验验证miR-199-3p和VegfA的靶向关系;TUNEL染色检测视网膜细胞凋亡;Western blot检测VEGFA、转化生长因子-β(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)、色素上皮衍生因子(PEDF)蛋白。结果成功建立糖尿病模型大鼠,且模型大鼠视网膜组织miR-199-3p显著下降,VEGFA显著升高(P<0.001);miR-199-3p靶向VegfA。miR-199-3p抑制显著降低视网膜神经节细胞数目,增强视网膜细胞凋亡,而抑制VegfA可显著减轻miR-199-3p抑制对视网膜细胞的损伤(P<0.01)。miR-199-3p过表达后TGF-β1、HGF显著降低,PEDF升高(P<0.001),而过表达miR-199-3p联合VEGFA可显著改变这种作用。结论miR-199-3p通过靶向VegfA抑制糖尿病大鼠视网膜病变。

基于JAK2/STAT3/VEGFA信号通路探讨黄芪总黄酮对人类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞的作用机制

目的:探讨黄芪总黄酮对人类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞(RA-FLS)细胞功能、血管生成的影响及相关分子机制。方法:黄芪总黄酮体外干预RA-FLS细胞,CCK-8检测细胞增殖能力;划痕实验观察细胞迁移能力;流式细胞术检测细胞凋亡;Western Blot检测IL-6、IL-10、Bax、Bcl-2及JAK2/STAT3/VEGFA通路蛋白表达。结果:与空白对照组比较,黄芪总黄酮高浓度组细胞增殖率、迁移率及Bcl-2、IL-6、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达显著降低,凋亡率及Bax、IL-10蛋白表达显著升高(P<0.05~P<0.001)。与甲氨蝶呤组比较,黄芪总黄酮高浓度组细胞迁移率、STAT3蛋白表达显著降低,凋亡率及Bax、IL-10蛋白表达显著升高(P<0.05或P<0.01)。与AG490抑制剂组比较,黄芪总黄酮+AG490抑制剂组JAK2蛋白表达显著降低(P<0.05)。与黄芪总黄酮高浓度组比较,黄芪总黄酮+AG490抑制剂组VEGFA蛋白表达显著降低(P<0.0001)。结论:黄芪总黄酮可能通过抑制JAK2/STAT3/VEGFA信号通路抑制RA-FLS细胞增殖、迁移及血管生成,诱导细胞凋亡,调节炎症细胞因子分泌。

黄芪甲苷通过DNA甲基化调节VEGFA参与急性低氧脑损伤的保护作用

目的:研究黄芪甲苷(AS-Ⅳ)通过影响DNA甲基转移酶表达变化来上调血管内皮生长因子A(VEGFA)表达水平减轻急性低氧造成的脑损伤。方法:以小鼠海马神经元细胞(HT22细胞)为研究对象,分为对照组(Control)、低氧组(Hypoxia)和黄芪甲苷处理组(H+AS-Ⅳ)。将HT22细胞低氧13 h复氧6 h构建低氧模型,H+AS-Ⅳ组于复氧的同时给与100μmol/L的黄芪甲苷药物处理。荧光倒置显微镜观察细胞形态变化;采用Real-time PCR检测DNA甲基化转移酶1(DNMT1)、DNA甲基化转移酶3A(DNMT3A)、DNA甲基化转移酶3B(DNMT3B)、VEGFA在mRNA水平上的表达变化;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测DNMT1、DNMT3A、DNMT3B在蛋白水平上的表达变化。结果:与对照组相比,低氧后,HT22细胞胞体变小,触角变短。DNMT1、DNMT3A的mRNA水平和蛋白水平均有所下降(P<0.05),DNMT3B则表达上升(P<0.05),VEGFA的mRNA水平下降(P<0.05)。与低氧组相比,给予AS-Ⅳ治疗后细胞形态有所改善。DNMT1、DNMT3A的mRNA水平和蛋白水平均无变化,DNMT3B则有所降低(P<0.05),VEGFA的mRNA水平上升(P<0.05)。结论:黄芪甲苷可以下调低氧后DNMT3B的表达水平,发挥神经保护作用,这一保护机制可能是通过上调VEGFA的表达来发挥的。

miR-140-5p靶向调控VEGFA参与卵巢癌血管生成的作用机制

目的:探究miR-140-5p靶向调控VEGFA基因参与卵巢癌血管生成的作用机制。方法:采集实验组织标本和细胞系,qRT-PCR检测组织和细胞中miR-140-5p和VEGFA的表达水平。Western blot检测VEGFA及血管生成相关因子STAT3、HIF-1α和bFGF的表达。应用流式细胞术检测转染细胞凋亡情况。结果:卵巢癌组织和细胞中miR-140-5p低表达,VEGFA为高表达(均P<0.05)。荧光素酶报告法确认VEGFA为miR-140-5p靶点。上调miR-140-5p表达,可降低卵巢癌细胞株CAOV3中VEGFA表达,下调miR-140-5p表达,可诱导VEGFA表达(均P<0.05)。与mimic NC+VEGFA-NC组相比,miR-140-5p mimic+VEGFA-NC组miR-140-5p表达量增加(P<0.05),而VEGFA mRNA和蛋白表达量变化未达明显统计学差异(均P>0.05);与miR-140-5p mimic+VEGFA-NC组相比,miR-140-5p mimic+VEGFA-siRNA组miR-140-5p表达量显著增加,VEGFA的mRNA表达量显著下降(P<0.05),且STAT3、HIF-1α、bFGF mRNA和蛋白表达量均显著下降(均P<0.05)。同时,与mimic NC+VEGFA-NC组和miR-140-5p mimic+VEGFA-NC组相比,miR-140-5p mimic+VEGFA-siRNA组细胞凋亡率明显增加,差异有显著统计学意义(P<0.05)。结论:miR-140-5p在卵巢癌中低表达,VEGFA高表达,miR-140-5p能特异结合VEGFA基因;上调miR-140-5p表达靶向下调VEGFA表达可降低卵巢癌血管生成相关因子表达并诱导癌细胞凋亡,为卵巢癌分子靶向治疗提供生物学证据。

miR-206过表达靶向VEGFA对人肝癌HepG2细胞侵袭和迁移的抑制作用

目的探究miR-206过表达对人肝癌Hep G2细胞侵袭和迁移的影响及其分子机制。方法 Hep G2细胞分为四组:Hep G2空白对照组,miR-206 mimic组,pc-VEGFA组和miR-206 mimic+pc-VEGFA组。qRT-PCR检测miR-206表达和VEGFA的mRNA水平。荧光素酶实验确认miR-206与VEGFA的靶向关系。Western blot检测VEGFA,抗波形蛋白,N-钙粘蛋白和纤维连接蛋白的表达。Transwell检测细胞侵袭。划痕实验分析细胞迁移。结果转染miR-206 mimic后Hep G2细胞中miR-206表达显著上升,VEGFA的mRNA水平显著下降(P<0.001)。miR-206与VEGFA存在直接靶向关系。与对照组相比,miR-206 mimic组VEGFA的蛋白水平,每个视野下的侵袭细胞数目,痕愈合率显著下降(P<0.01)。pc-VEGFA组VEGFA的蛋白水平,每个视野下的侵袭细胞数目,痕愈合率显著高于对照组(P<0.01)。与pc-VEGFA组相比,miR-206 mimic+pc-VEGFA组VEGFA的蛋白水平,每个视野下的侵袭细胞数目,痕愈合率显著降低(P<0.01)。miR-206 mimic组vimentin,N-cadherin和Fibronectin表达低于对照组(P<0.01)。pc-VEGFA组vimentin,N-cadherin和Fibronectin表达高于对照组(P<0.01)。与pcVEGFA组相比,miR-206 mimic+pc-VEGFA组vimentin,N-cadherin和Fibronectin表达降低(P<0.01)。结论miR-206过表达通过靶向VEGFA抑制人肝癌Hep G2细胞侵袭和迁移。

白藜芦醇抑制视网膜母细胞瘤株血管生成相关因子VEGFA、bFGF和Ang-2表达的机制

目的探讨白藜芦醇(Res)对人视网膜母细胞瘤株SO-RB50血管生成相关因子内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管生成素2(Ang-2)表达的影响。方法体外培养人视网膜母细胞瘤细胞SO-RB50细胞株,分别加入6.25、12.5、25、50、100μmol/L Res,对照组加等量0.5%二甲亚砜(DMSO),孵育24、48 h后,MTT方法观察Res对细胞生长抑制作用;RT-PCR、Western印迹分别测定50μmol/L Res处理48 h后VEGFA、bFGF和Ang-2 mRNA和蛋白的表达。结果 Res可显著抑制视网膜母细胞瘤细胞生长,且具有剂量和时间依赖性;Res作用后VEGFA、bFGF和Ang-2 mRNA和蛋白表达下降,与对照组间比较,差异均有统计学意义。结论 Res具有抗视网膜母细胞瘤血管生成的作用,其机制可能与下调血管生成相关因子VEGFA、bFGF和Ang-2表达有关。

miR-218-5p靶向VEGFA基因促进宫颈癌HeLa细胞凋亡并抑制迁移

目的探究miR-218-5p靶向VEGFA基因对宫颈癌HeLa细胞凋亡和迁移的影响。方法培养宫颈癌细胞HeLa,细胞分为miR-NC组、miR-218-5p组、si-NC组、si-VEGFA组、miR-NC+pcDNA-VEGFA组、miR-218-5p+pcDNA-VEGFA组。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-218-5p和VEGFA mRNA表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡;Transwell检测细胞迁移;蛋白质印迹(Western blot)法检测细胞B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bax、基质金属蛋白酶(MMP2)、MMP9蛋白表达;双荧光素酶报告实验检测miR-218-5p和VEGFA的靶向关系。结果与正常宫颈上皮细胞NC104比较,宫颈癌细胞HeLa、CaSki、C33A、SiHa中miR-218-5p表达降低,VEGFA mRNA表达升高(P<0.05)。与miR-NC组比较,细胞凋亡率升高,细胞迁移数降低(P<0.05)。与si-NC组比较,si-VEGFA组细胞凋亡率升高,细胞迁移数降低(P<0.05)。miR-218-5p靶向调控VEGFA表达,上调VEGFA表达可以逆转miR-218-5p过表达对宫颈癌细胞凋亡和迁移的影响(P<0.05)。结论miR-218-5p靶向VEGFA基因促进宫颈癌HeLa细胞凋亡并抑制迁移。

人血管内皮生长因子A(VEGFA)的原核载体构建、蛋白表达及鉴定

目的克隆人VEGFA基因,与原核载体融合表达、纯化及其鉴定,并将其应用于肿瘤血管生长研究过程中.方法采用PCR方法扩增人VEGFA序列,将其克隆入p GEX-KG原核载体,获得p GEX-KG-h VEGFA重组质粒.将该质粒转化入E.coli菌株BL21(DE3),经IPTG诱导其表达,以GSTrap亲和层析柱纯化融合蛋白,采用SDS-PAGE电泳,Western Blot方法鉴定融合蛋白的表达.结果 PCR扩增获得了h VEGFA基因片段,经测序证实与Gen Bank公布的序列一致,重组的质粒载体经过PCR、酶切鉴定,证明重组质粒中已成功的插入了h VEGFA基因片段.成功构建了该蛋白的原核表达载体p GEX-KG-h VEGFA.结论融合蛋白在IPTG终浓度为0.5 mmol/L、25℃条件下诱导表达,并获得纯化融合蛋白.采用Western Blot的方法可检测到目的融合蛋白GST-h VEGFA的表达.

miRNA-613靶向VEGFA调控乳腺癌细胞吉西他滨耐药性的机制研究

目的探讨微小RNA613(miRNA-613)靶向血管内皮生长因子A(VEGFA)在乳腺癌吉西他滨(GCB)耐药性中的作用机制。方法采用GCB浓度梯度递增法体外建立人乳腺癌GCB耐药细胞株MDA-MB-231/GCB。采用LipofectamineTM 2000 脂质体法将miRNA-613 模拟物(mimics)和空质粒转染至MDA-MB-231/GCB 细胞中,分别作为转染组和空质粒转染组(NC组),将未进行任何处理的MDA-MB-231/GCB 细胞作为对照组(CTL组)。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度(0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3 μmol/L)的GCB 条件下MDA-MB-231 细胞和MDA-MB-231/GCB 细胞的增殖活性。采用MTT法、膜联蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)/碘化丙啶(PI)双染法、划痕实验检测GCB对各组细胞增殖、迁移和凋亡的影响。采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测多药耐药基因1(MDR1)和B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)基因、B细胞淋巴瘤/白血病-xL(Bcl-xL)基因、Bcl-2 细胞死亡调节介质(BIM)基因、存活蛋白(survivin)基因mRNA 的相对表达量。采用双荧光素酶报告基因实验验证VEGFA与miRNA-613的靶向调控关系并通过实时荧光定量PCR法验证。结果经过6个月的诱导期,成功建立体外MDA-MB-231/GCB 耐药细胞株。不同浓度(0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3 μmol/L)的GCB条件下MDA-MB-231/GCB细胞的增殖抑制率均明显低于MDA-MB-231 细胞(P﹤0.01),GCB对MDA-MB-231 细胞和MDA-MB-231/GCB 细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为1.772 μmol/L 和8.791 μmol/L,MDA-MB-231/GCB 的耐药指数(RI)为4.96;转染组MDA-MB-231/GCB 细胞miRNA-613 相对表达量高于CTL 组和NC 组(P﹤0.05);不同浓度(0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3 μmol/L)的GCB条件下转染组MDA-MB-231/GCB 细胞的增殖抑制率均高于CTL 组和NC组(P﹤0.05),GCB 对CTL 组、NC组和转染组细胞的IC50分别为8.791、8.817、3.411 μmol/L;加入3.411 μmol/L 的GCB 分别作用于CTL 组、NC 组和转染组MDA-MB-231/GCB 细胞后,转染组细胞的迁移活性弱于CTL 组和NC 组(P﹤0.05),GCB 对转染组MDA-MB-231/GCB 细胞凋亡的促进作用强于CTL 组和NC 组(P﹤0.05);转染组细胞survivinmRNA、MDR1 mRNA的相对表达量均低于CTL 组和NC组(P﹤0.05);miRNA-613 mimics 转染前,MDA-MB-231/GCB 细胞VEGFA mRNA 的相对表达量高于MDA-MB-231 细胞(P﹤0.05);miRNA-613 mimics 转染后,转染组MDA-MB-231/GCB 细胞VEGFA mRNA相对表达量低于CTL 组和NC 组(P﹤0.05);双荧光素酶报告基因分析结果显示,miRNA-613 mimics 转染后,野生型VEGFA 3'端非翻译区(3'-UTR)序列的报告基因质粒荧光酶活性弱于转染前。结论上调miRNA-613的表达量,可抑制VEGFA的表达,从而逆转MDA-MB-231/GCB细胞株对GCB的耐药性,可能成为乳腺癌治疗的新靶点。

VEGFA,HIF1A和EPAS1基因多态性与猪繁殖性状的相关研究(英文)

在梅山猪保种群和法系大白猪群体中采用直接测序法和PCR-RFLP法对基因VEGFA、HIF1A和EPAS1进行了基因多态位点的寻找及多态性检测并对不同基因型的总产仔数、产活仔数等繁殖性状进行了相关分析。在所获得的基因VEGFA的扩增片段中共检测到17个多态位点,其中有4个位点可进行PCR-RFLP检测,分别为BstH2I-RFLP,PspEI-RFLP,Eco32I-RFLP和BcnI-RFLP,而在HIF1A和EPAS1扩增片段中未获得可进行PCR-RFLP检测的多态位点。在2个实验猪群中对VEGFA基因的4个多态位点进行基因型及等位基因频率分析,结果表明:VEGFA基因的BstH2I、Eco32I、PspEI 3个多态位点在梅山猪群体中A等位基因占优势,BcnI多态位点在梅山猪群体中B等位基因占优势,而在法系大白猪群体中VEGFA基因的BstH2I、Eco32I、PspEI和BcnI 4个多态位点的相关基因型和等位基因分布极不均衡。BstH2I和PspEI多态位点相关的A等位基因频率在法系大白猪群体中为0,而Eco32I和BcnI多态位点相关的A、B等位基因频率在法系大白猪群体中不到1%。单倍体型推断结果表明VEGFA基因4个多态位点在梅山猪群体中共存在10种单倍体型,而在法系大白猪群体中只存在2种单倍体型BBBA和BBAB,且只有一个个体的单倍体型是BBAB。通过性状关联分析,发现梅山猪群体中VEGFA基因单倍体型BBBA对初产总仔数影响显著(P<0.05);单倍体型BABA对经产总仔数和经产活仔数影响显著(P<0.05);单倍体型BBAA对初生窝重影响显著(P<0.05)。使用辐射杂种克隆板将基因VEGFA定位于SSC7q11-12;基因HIF1A定位于SSC1;基因EPAS1定位于SSC3q11-14。而所获得的基因HIF1A和EPAS1的扩增片段无PCR-RFLP可识别的SNP位点。研究结果表明猪VEGFA基因具有成为影响猪繁殖性状分子遗传标记的潜力。