Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP0基因在杆状病毒表达系统中的表达

为在昆虫细胞中表达Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus type-Ⅰ,DHAV-Ⅰ)SH株的结构蛋白VP0,首先根据DHAV-Ⅰ SH株VP0基因序列设计一对引物,RT-PCR方法扩增出VP0基因,亚克隆至杆状病毒转移载体pFast Bac1,获得重组质粒p FB-VP0,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒rBacmid-VP0,在脂质体介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-VP0。Western-blot结果显示,表达的重组蛋白相对分子量约为29 k D,间接免疫荧光结果显示重组蛋白能与鸭抗全病毒阳性血清发生特异性反应。研究结果表明,DHAV-Ⅰ SH株的结构蛋白VP0在昆虫细胞中获得了成功表达,为VP0结构蛋白的功能研究和基因工程疫苗的研制奠定了基础。

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP0基因的原核表达与多抗的制备

根据Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(Duck Hepatitis A Virus type-Ⅰ,DHAV-Ⅰ)SH株VP0基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR方法扩增出VP0基因,克隆入原核表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下重组蛋白获得了成功表达。SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白相对分子量约为48 k D,Western-blotting分析表明该蛋白能与His组氨酸单抗发生特异性反应。将目的蛋白切胶纯化后免疫ICR小鼠,制备了针对重组蛋白的多抗血清,Western-blotting分析证明制备的抗血清能够与DHAV-Ⅰ感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,VP0基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于VP0蛋白的检测。

禽脑脊髓炎病毒VP1、VP3、VP0基因表达载体的构建

根据AEV-NH937基因组全序列设计3对引物,应用RT-PCR方法,扩增出AEV的外壳蛋白VP1、VP3、VP0基因,将它们克隆于pUCm-T载体上进行序列分析。结果显示,AEV-NH937病毒株VP1基因全长810 bp、编码270个氨基酸,VP3基因全长735 bp、编码245个氨基酸,VP0基因全长726 bp、编码242个氨基酸;与Calnek疫苗株相比,AEV-NH937病毒株VP1、VP3、VP0基因的核苷酸同源性分别为90.62%、93.88%、95.45%,氨基酸同源性分别为88.89%、97.96%、98.35%。将VP1、VP3、VP0基因分别插入载体pcDNA4/His Max构建表达重组质粒并转入宿主菌DH5α中,使基因得以表达。

利用SUMO表达系统高效表达猪O型口蹄疫病毒VP0、VP1、VP3基因

根据GenBank中公布的猪O型口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)全基因合成了FMDV结构蛋白前体蛋白P1基因,同时设计了扩增FMDV结构蛋白VP0、VP1和VP3基因的引物。以P1基因为模板,分别经PCR扩增获得FMDV VP0、VP1和VP3基因。扩增产物克隆于Blunt载体中,酶切后将目的片段连接到原核表达载体SUMO中,构建重组表达质粒SUMO-VP0、SUMO-VP1和SUMO-VP3,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS进行诱导表达。经SDS-PAGE电泳可见融合蛋白均获得高效表达,融合蛋白表观分子质量分别约为55、48和40 ku。在IPTG浓度为1.0 mmol/L,温度为37℃,诱导5 h时融合蛋白表达量最大。Western blotting结果表明,融合蛋白均可被FMDV阳性血清识别,反应原性良好。

A型口蹄疫病毒VP0基因的克隆及原核表达

从实验室冻存的含A型口蹄疫病毒的细胞中提取FMDV总RNA,通过RT-PCR获得cDNA。并根据FMDV全基因组序列设计了一对针对VP0基因的引物,通过PCR扩增得到目的基因VP0并亚克隆入pMD18-T载体。将鉴定出的阳性质粒和表达载体pET32a用BamHⅠ和HindⅢ双酶切回收后连接获得阳性重组质粒pET32-VP0。用IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白VP0并用SDS-PAGE进行检测。表达产物用镍亲和树脂进行了纯化。结果证明,口蹄疫病毒VP0蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达且表达产物得到了纯化,为实验室进一步的研究提供了重要的材料。

传染性法氏囊病病毒VP2/VP0基因在重组鸡痘病毒中的表达

以鸡痘病毒复制非必需区ＴＫ基因为侧翼，在牛痘病毒Ａ型包涵体晚期启动子（ＡＴＩ）与１６个串联的突变型早期痘苗病毒ｐ７．５启动子组成的复合启动子的下游，分别插入编码传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）结构蛋白ＶＰ２和ＶＰ２－４－３（ＶＰ０）的基因片段后，进行了同源重组和蓝斑筛选，获得２株重组病毒ｖＵＴＡＬａｃＶＰ２－７和ｖＵＴＡＬａｃＶＰ０－１０。经ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表明，重组病毒ｖＵＴＡＬａｃＶＰ２－７能表达ＶＰ２，ｖＵＴＡＬａｃＶＰ０－１０能表达ＶＰ２和ＶＰ３，ＶＰ２和ＶＰ３的Ｍｒ分别为４１０００和３２０００。

血清Ⅲ型鸭甲型肝炎病毒VP0蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

血清Ⅲ型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)属于小RNA病毒科,主要引起雏鸭以肝脏肿胀、出血为主的急性、烈性传染病。DHAV-3有3个主要结构蛋白,其中VP0蛋白具有极佳的抗原性及宿主保护位点。为研制鸭肝炎病毒VP0蛋白的单克隆抗体,本研究将鸭肝炎病毒的VP0基因进行原核表达,用纯化后的重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、IFA筛选以及亚克隆后,获得了1株能够稳定分泌抗VP0蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞3A5,亚类鉴定为IgG1,IFA检测腹水效价为1∶12800。Western blot、IFA结果表明,制备的单克隆抗体效价高,反应原性强。本研究为后续建研制血清Ⅲ型鸭甲型肝炎病毒的快检试剂盒,及建立病原及抗体检测方法奠定基础。

猪嵴病毒VP0基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

本研究旨在建立一种检测猪嵴病毒(PKV)抗体的间接ELISA检测方法。通过原核表达系统表达PKV VP0基因作为包被抗原,并通过Western blot鉴定证明重组蛋白与PKV阳性血清能发生良好的特异性反应。优化反应条件,得出PKV VP0间接ELISA检测方法最适反应条件是抗原包被浓度为0.62μg/mL,血清稀释浓度为1∶200,最佳酶标二抗稀释浓度1∶5000,使用5%脱脂奶粉作为封闭液37℃孵育1 h,显色10 min,当检测样品OD_(450)<0.225判定血清样品抗体为阴性,OD_(450)≥0.225判定血清样品抗体为阳性,且特异性高、重复性好,与Western blot符合率达到95.6%。PKV VP0蛋白间接ELISA方法的建立,作为一种操作简单,灵敏度高,特异性高,重复性好的血清学检测方法,为PKV的监测和预防提供了技术支持。

共表达NDV F和IBDV VP0基因重组鸡痘病毒遗传稳定性研究

将共表达NDVF和IBDVVP0基因重组鸡痘病毒（重组鸡痘病毒vFV282）接种10日龄～11日龄SPF鸡胚，连续传10代，分别对第5、8、10代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定；重组鸡痘病毒vFV282接种鸡胚成纤维细胞，分别对第1、5、10、15、20、25、30代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定；重组鸡痘病毒vFV282翅翼刺种于鸡体上，连续传8代，对第3、5、8代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定。结果表明，重组鸡痘病毒vFV282在SPF鸡胚上传10代、在SPF鸡胚成纤维细胞传30代、在鸡体传8代后，其毒力未返强，F基因和VP0基因未发生缺失和变异。

禽脑脊髓炎病毒Van Roekel株衣壳蛋白基因原核表达及其ELISA检测研究

利用RT PCR方法扩增了禽脑脊髓炎病毒VP0、VP3和VP1基因 ,分别插入pGEX 4T 1原核表达载体 ,转化到E .coliER2 566表达菌内 ,经IPTG诱导表达后 ,SDS PAGE分析表达产物。结果表明 ,表达的VP0、VP3、VP1融合蛋白分子量分别为 53 ,53 ,56ku。以电洗脱法纯化VP0、VP3、VP1表达蛋白抗原并分别建立了间接ELISA方法 ,用阳性血清和阴性血清进行检测。结果显示 ,表达VP1蛋白反应活性相对高于VP0、VP3蛋白反应活性 ,最后再将自制VP1板用自配试剂检测其活性 ,同时用美国试剂盒检测VP1活性 ,美国ELISA试剂盒、琼脂扩散试验检测同样 1 0份血清作比较 ,三组ELISA检测结果 ,其中有 8份被检血清为阳性 ;2份被检血清为阴性。这一结果与琼脂扩散试验检测结果一致。说明VP1表达蛋白活性达到预期要求 。