鸡群中鸡传染性贫血病原与抗体检测及分离株VP1基因序列分析

为了解鸡群中鸡传染性贫血病毒(CAV)感染及抗体产生情况,从黑龙江省两个无临床症状鸡群(B群和S群)中,分别采集血清通过ELISA方法进行抗体检测,采集抗凝血并分离淋巴细胞,针对基因组保守序列设计引物,通过PCR方法进行病原检测,并对从B群病原阳性鸡分离到的分离株进行VP1基因序列分析。结果显示,B群和S群CAV抗体阳性率分别为62.7%(79/126)和68.2%(88/129),病原阳性率分别为43.0%(49/114)和62.3%(48/77),其中,B群和S群中抗体和病原双阴性的鸡分别为23.7%(27/114)和15.6%(12/77),而抗体和病原双阳性的鸡分别高达28.1%(32/114)和46.8%(36/77);在双阳性鸡中,B群和S群分别有62.5%(20/32)和58.3%(21/36)抗体滴度在1.0×10^(4)及以上,从B群病原阳性鸡全血中分离到一株CAV(HLJ/2022株),分离株HLJ/2022第394位氨基酸为谷氨酰胺,具有强毒的分子特征;两个鸡群的环境拭子CAV阳性率为10.0%(3/30),存在于消毒前的鸡蛋表面、更衣处和鞋底。研究表明,检测鸡群的CAV抗体阳性率在62.7%以上,病原阳性率在43.0%以上,抗体滴度在1.0×104及以上CAV仍可存在,CAV流行株(HLJ/2022)具有强毒分子特征,鸡群环境中存在CAV污染,结果为CIA防控提供重要的参考意见。

A型塞内卡病毒VP1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

A型塞内卡病毒(SVA)是一种新兴的猪病原体,可引起母猪水泡样病变和仔猪急性死亡。本研究将SVA的VP1基因分别克隆到原核表达载体pCold-I和pCold-TF,并将测序正确的重组质粒VP1-pCold-I、VP1-pCold-TF转化BL21(DE3)大肠杆菌中,诱导表达重组蛋白。结果显示:VP1-pCold-I表达的目的蛋白在沉淀(包涵体)中,VP1-pCold-TF表达的蛋白为可溶性蛋白。分别纯化上述表达的蛋白,并免疫BALB/c小鼠,经四次免疫后得到多克隆抗体。经Western blot和间接免疫荧光(IFA)鉴定,制备的多克隆抗体具有良好的Western blot效价和IFA效价,为相关基础研究和应用研究提供了工具。

IFN-β表达与牛细小病毒VP1蛋白感染宿主细胞的机制研究

目的:系统研究IFN-β表达水平对牛细小病毒(BPV)VP1蛋白感染宿主细胞的作用与基础机制.方法:设计BPV Haden株(GenBank No:DQ335247)蛋白序列,提取其DNA,PCR扩增,构建BPV VP1和VP2真核表达载体,qRT-PCR检测HEK-293T细胞中VP1和VP2基因表达及细胞活力,Western blotting验证蛋白表达,检测拷贝数.用BPV VP1重组质粒转染HEK-293T细胞,提取RNA,qRT-PCR检测IFN-β水平以及Mx1、OAS1、ISG15、ISG56的mRNA水平、TBK1和IRF3转录水平.应用pCMV-Myc-BPV-VP1蛋白、TBK1、IRF3(5D)、MDA5和MAVS分别转染HEK-293T细胞,进行Western blotting和qRT-PCR,检测其表达水平.结果:对重组质粒进行双酶切鉴定,得到2022 bp和1611 bp的VP1和VP2片段,大小与预期相符;VP1和VP2 mRNA表达量比对照组分别增加5.5×10^(4)和7.4×10^(5)倍(P<0.001),BPV VP1组的病毒拷贝数比对照组增加5.8×10^(4)拷贝(P<0.001);BPV VP1显著抑制HEK-293T细胞中VSV介导的IFN-β产生;BPV VP1显著下调Mx、OAS、ISG15、ISG56表达水平,分别达30%、90%、84%和20%(P<0.01);TBK1和IRF3(5D)激活HEK-293T细胞中IFN-β产生,而且BPV VP1可使TBK1和IRF3转录水平下降81%和89%,使IFN-β生成量减少97%和90%.TBK1、IRF3(5D)、MDA5和MAVS均在HEK-293T细胞分布和表达,大小为84 kDa、55 kDa、118 kDa和58 kDa.转染pCMV-Myc-BPV-VP1蛋白后,TBK1、IRF3(5D)、MDA5和MAVS的表达水平均显著降低(P<0.001).结论:BPV VP1和VP2基因在HEK-293T细胞中高表达,BPV VP1蛋白显著促进BPV的体外增殖,并通过抑制ISGs转录水平,减少VSV介导的Mx、OAS、ISG15、ISG56转录水平.此外,显著抑制BK1和IRF3(5D)诱导的IFN-β生成,即BPV VP1蛋白通过IRF3或其通路降低IFN-I的抗病毒作用.pCMV-Myc-BPV-VP1能降低RLRs通路中TBK1、IRF3(5D)、MDA5和MAVS的表达水平.

表达鸡传染性贫血病毒VP1蛋白的新型重组血清4型禽腺病毒的构建

为研制新型鸡传染性贫血(CIA)高效疫苗以解决国内商品鸡群中普遍存在的鸡传染性贫血病毒(CIAV)感染问题,试验利用CRISPR-Cas9技术和Cre-LoxP系统,以血清4型禽腺病毒(FAdV-4)为载体,构建表达CIAV VP1蛋白的重组FAdV-4。通过间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹试验对重组病毒进行验证,通过体外病毒生长曲线来研究其复制效率。结果显示:该重组病毒构建成功,能有效表达CIAV VP1蛋白,命名为rFAdV-4-CIAV-VP1,且发现rFAdV-4-CIAV-VP1在LMH细胞中的复制效率远低于野生型FAdV-4。研究表明构建的重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1为CIAV和FAdV-4的联防联控提供了二联候选疫苗株。

鸭3型甲肝病毒的分离鉴定与VP1基因序列分析

【目的】探明引起安徽某鸭场雏鸭肝脏出血和大量死亡的病原及其遗传进化特征。【方法】对安徽省某鸭场的病死雏鸭中采集的出血肝脏开展鸭已知病原核酸检测、病原分离鉴定和动物回归试验,在明确其病原为鸭3型甲肝病毒(Duck hepatitis A virus type 3,DHAV-3)的基础上分析其VP1基因序列分子特征。【结果】细菌分离结果显示,未分离到细菌;经病毒核酸(RT-)PCR检测结果显示,鸭3型甲肝病毒(DHAV-3)核酸阳性,未检测出其他已知引起鸭肝出血的病毒核酸。将该阳性样品经鸭胚进行病毒分离与传代,发现接种后鸭胚发生死亡,胚体全身出血,对第5代尿囊液经RT-PCR检测为DHAV-3,将其命名为AH230225。经测定,该分离株的鸭胚半数致死量(Effective lethal dose 50,ELD_(50))为10^(−4.17)/0.1 mL。动物回归试验表明,该毒株对樱桃谷雏鸭的致死率为80%,且攻毒死亡鸭肝脏和肾脏的剖检病变与临床典型病变相近。对该分离毒的VP1基因核苷酸序列进行同源性分析,显示AH230225株的VP1基因核苷酸序列与AH07株DHAV-3(安徽分离株)的同源性最高,为98.8%,与GenBank登录的10株DHAV-3分离株VP1基因核苷酸序列同源性为90.4%~98.8%,而与DHAV-1和DHAV-2的VP1基因核苷酸序列同源性分别为62.1%~63.0%、64.6%~64.9%;基于VP1蛋白氨基酸序列的遗传进化显示,该分离株与AH07株DHAV-3处于同一小进化分支上,亲缘关系最近;而与SD01株、G株和韩国株(AP-04009、AP-03337)等亲缘关系较远,即远离DHAV-1和DHAV-2进化分支。【结论】引起安徽某鸭场雏鸭肝脏出血和大量死亡的病原为鸭3型甲肝病毒DHAV-3,同时明确了该毒株VP1基因的分子特征及遗传进化规律,为深入研究DHAV-3的致病机制和制定防控措施提供科学依据。

猪肠病毒G型部分VP1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

本研究扩增猪肠病毒G型(EV-G)的部分VP1基因,将其克隆至原核表达载体,并对其进行诱导表达,获得重组蛋白并制备多克隆抗体,通过酶联免疫吸附试验,免疫印迹试验和间接免疫荧光试验对其进行验证。结果表明,本研究制备的兔抗EV-G-VP1多克隆抗体具有良好的免疫原性和反应性,可以特异性识别EV-G感染Marc-145细胞表达的VP1蛋白,为猪肠病毒G型免疫学检测方法的建立提供良好的生物学材料。

北京地区猫杯状病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析

为了解猫杯状病毒(FCV)新流行毒株的流行情况、变异特点及致病性,通过收集2016-2022年4月北京地区多家宠物医院就诊疑似感染FCV的猫眼、鼻、咽拭子进行RT-PCR检测和分离培养,对分离到的5株FCV进行病毒含量测定、VP1基因序列分析,并对其中1株进行致病性试验。结果显示,2018-2022年4月阳性率分别为36.98%、34.30%、41.33%、40.46%和34.39%,总阳性率为37.93%。5株FCV分离株VP1基因核苷酸和氨基酸同源性分别为74.1%~85.4%和83.6%~91.0%;5株FCV分离株与国内疫苗株255株核苷酸和氨基酸同源性分别为74.8%~84.5%和83.7%~91.6%;与国内疫苗株255株、国外疫苗株F9株在不同的小分支上。致病性试验结果显示,猫感染BJH13株FCV后出现精神沉郁、食欲减退、体温升高、体重下降、眼鼻分泌物增多和舌泛红、溃疡等典型感染FCV临床症状;FCV感染猫的舌和肺脏组织病理切片结果显示,FCV侵染猫舌和肺脏并呈典型感染FCV病理特征。以上结果表明,FCV阳性率高;分离株BJH13株致病力强;FCV VP1基因序列变异大,与目前临床使用的疫苗株255、F9株VP1基因存在明显差异,存在疫苗免疫失败的风险。这对现阶段FCV防控带来了巨大挑战,同时为今后的疫苗研发提供了候选毒株和科学依据。

云南省昆明地区2022年柯萨奇病毒A16型的VP1区分子特征

目的对昆明市某医院2022年从手足口病患儿分离的柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CVA16)的全VP1基因区分子特征分析。方法对昆明市某医院2022年从手足口病(hand foot mouth disease,HFMD)患儿200份临床样品粪便标本进行处理,分别通过RD细胞和Vero细胞分离,对经3次培养后仍产生细胞效应(cytopathogenic effect,CPE)的细胞培养液提取病毒核酸,然后用通用引物222/224经RT-PCR扩增并测序,序列经BLAST比对确定其血清型,对鉴定为柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CVA16)的再用特异引物CA16VP1F/CA16VP1R扩增其全VP1区并测序和拼接。下载CVA16病毒标准序列,采用Geneious 5.4.1和MEGA 6.05等软件对本研究CVA16的全VP1区的核苷酸和氨基酸序列分析。结果经鉴定后共检出22株从Vero细胞分离CVA16和6株RD细胞分离的CVA16毒株,进一步通过特异引物扩增获得21株可用的CVA16VP1全长序列,基于全VP1基因系统进化分析,这21株CVA16全属于B1a基因型。21株CVA16全长VP1基因之间的核苷酸和氨基酸序列同源性均较高,分别为91.9%~99.6%和89.2%~99.3%;与中国CVA16 B1a基因型的其他株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.7%~96.3%和89.2%~97.0%。与CVA16 B1b其他参考株对比,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别在84.3%~87.2%和89.2%~97.0%。与其它CVA16的B1a基因亚型相比较发现21个氨基酸位点出现变异。结论2022年中国云南省昆明某医院引起HFMD的CVA16毒株属于B1a基因型,应继续监测以明确其流行特征。

新疆和田地区鹅细小病毒感染调查及VP1基因遗传进化分析

为了解新疆和田地区鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)的感染情况及遗传进化特征,试验采集新疆和田地区和田县、于田县、皮山县鹅养殖场的578只死亡雏鹅的内脏(肝脏、脾脏)及肛拭子样本(和田县344只,于田县67只,皮山县167只),采用PCR方法对鹅细小病毒进行检测,并随机选取2份阳性病料样本对鹅细小病毒VP1基因进行PCR扩增、测序、BLAST比对和遗传进化分析。结果表明:共检测出44份鹅细小病毒阳性样品,总阳性率为7.61%(44/578),其中新疆和田地区和田县鹅细小病毒阳性率为12.50%(43/344),于田县鹅细小病毒阳性率为1.49%(1/67),皮山县未检测到鹅细小病毒。随机选取的2株鹅细小病毒(XJHT-1、XJHT-2株)均为经典鹅细小病毒,与鹅细小病毒各参考毒株VP1基因编码氨基酸序列相似性分别为89.5%~95.8%和92.1%~97.3%,与番鸭细小病毒参考毒株VP1基因编码氨基酸序列相似性分别为76.0%~85.4%和78.5%~88.7%。鹅细小病毒XJHT-1、XJHT-2株与鹅细小病毒DY16株(中国江苏)的相似性最高,分别为95.8%和97.3%,遗传距离最近;XJHT-1株与鹅细小病毒GD株(中国广东)和SD-F30株(中国河北)的相似性较低,分别为89.5%和89.6%;XJHT-2株与鹅细小病毒SHM319株(德国)、GD株(中国广东)和SD-30株(中国河北)的相似性较低,分别为92.1%、92.8%和92.8%。说明和田地区部分鹅场存在鹅细小病毒的感染,但阳性率较低,选取的2株毒株与鹅细小病毒DY16株(中国江苏)的氨基酸序列相似性最高,推测可能由鹅细小病毒DY16株进化而来。

2020—2023年山东地区13株3型鸭甲型肝炎病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析

为研究2020—2023年山东地区3型鸭甲型肝炎病毒的流行变异情况,试验采集了山东地区13份疑似鸭肝炎病毒感染的病料,通过病毒分离、RT-PCR扩增鉴定,并进行VP1基因测序及遗传变异分析。结果显示:共分离到13株3型鸭甲型肝炎病毒,均属于GⅠa分支,且分属于GⅠa分支不同小分支,其中2020年分离株(20148、20149)与2021年商品肉鸭分离株(SP21042)核苷酸相似性在98.8%~100%;2023年商品鸭分离株(SP23012、SP23014、SP-2、SP-3、SP23009)核苷酸相似性在99.7%~100%;2021年种鸭分离株(21083)与2022年、2023年种鸭分离株(22443、22468、BL23028)、2023年商品鸭分离株(SP23010)核苷酸相似性在98.8%~99.4%,小分支内相似性均高于98.8%,不同小分支间相似性在96.9%~98.2%;2023年部分3型DHAV分离株VP1基因出现了个别氨基酸位点的突变。研究表明,山东地区分离的13株GⅠa分支鸭甲型肝炎病毒VP1基因出现了变异,需要加以关注。

猪萨佩罗病毒HNHB-01株VP1基因的表达与分子特征

猪萨佩罗病毒(PSV)VP1蛋白是位于病毒粒子表面的结构蛋白,发挥主要的抗原效应。为了弄清PSV HNHB-01株VP1基因的表达与分子特征,本研究设计针对VP1基因的特异性引物,通过RT-PCR扩增获得VP1基因,并重组到真核表达载体pCAGGS上,经Western blot、间接免疫荧光鉴定,成功表达VP1蛋白。随后基于PSV HNHB-01株全基因序列以及VP1基因序列与其他参考毒株的基因序列构建遗传进化树,分析遗传进化关系。结果表明:实验室分离的HNHB-01株与2017年分离的HNXX-01株亲缘关系最近,与日本株JPSV-1315关系接近;HNHB-01 VP1基因与国内2016-2017年流行的毒株HNXX-01、PSV-A2、JXXY-a2的VP1基因高度同源,与国外2009年流行的日本毒株JPSV1315的VP1基因亲缘关系较近;HNHB-01株VP1氨基酸与HNXX-01株VP1氨基酸同源性最高,同源性为99.32%。三级结构分析表明,VP1蛋白存在3条位于蛋白结构外侧的抗原表位区,对应的氨基酸序列分别为20~30 aa、90~100 aa和265~275 aa。本研究为PSV感染的诊断与预防提供依据,并为今后研究VP1基因的功能和开发疫苗奠定基础。

柯萨奇病毒A组10型VP1蛋白线性中和表位的筛选和鉴定

柯萨奇病毒A组10型(CV-A10)是引起手足口病(HFMD)的常见病原体之一。应用重叠肽法筛选出覆盖CV-A10全长VP1区氨基酸序列的39条候选表位肽段,以间接酶联免疫吸附试验(ELISA)及微量中和抑制试验验证。结果发现,候选表位P6(CV-A10 VP1区第39~53位氨基酸)与CV-A10全病毒抗血清具有高反应性,且在3.91μg/mL的稀释质量浓度时仍具有中和抑制作用,为潜在中和表位。用P6肽免疫小鼠制备相应的抗血清,并以微量中和试验验证其保护能力,结果显示,P6抗血清的几何平均中和效价为1:8.97,可确定P6为CV-A10的中和表位。为了解P6序列在CV-A10型内的保守性,将P6的氨基酸序列与CV-A10各基因型代表株进行比对分析,结果显示,P6在CV-A10型内高度保守,表明P6为CV-A10的广谱性中和表位,可应用于CV-A10表位疫苗的研发。本研究旨在筛选鉴定CV-A10 VP1蛋白上的线性中和表位,为CV-A10表位疫苗的研发和HFMD的防控奠定基础。

《庄子·内篇》“VP_(1)而VP_(2)”“NP之VP”结构研究

连词“而”是一个高频虚词,当它连接两个动词性词语VP_(1)、VP_(2)时,用法较为复杂。根据两个VP之间的句法语义关系,《庄子·内篇》中的“VP_(1)而VP_(2)”结构可以分析为四种类型:连谓、偏正、联合、紧缩。“NP之VP”结构在《内篇》中的出现频率也比较高。结构助词“之”置于主谓结构“NP+VP”中间,形成体词性偏正结构“NP之VP”,相当于现代汉语“NP的VP”。该结构在句法上只能分布于主、宾位;在语义上不具有独立性,是谓语核心动词的论元成分;在语用上具有指称功能。

基因1型鹅星状病毒VP27蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备可特异性识别基因1型鹅星状病毒(Goose astrovirus genotype 1,GAstV-1)且与GAstV-2不发生交叉反应的多克隆抗体,以期为后续GAstV-1免疫检测技术的建立提供材料。【方法】通过比对GAstV-1与GAstV-2衣壳蛋白的氨基酸序列以寻找其差异较大的区域作为靶基因。对GAstV-1 GDYJ-21-01株VP27基因密码子进行偏嗜性优化合成,构建原核表达质粒pCZN1-GAstV-1 VP27,转化大肠杆菌Top10感受态细胞以诱导表达VP27蛋白;将纯化后的VP27蛋白免疫新西兰白兔后收获抗血清以制备GAstV-1 VP27多克隆抗体,通过间接ELISA和SDS-PAGE分析该纯化抗体的效价和纯度,并利用间接免疫荧光试验(IFA)检测多克隆抗体的特异性。【结果】试验成功构建重组质粒pCZN1-GAstV-1 VP27;SDS-PAGE显示其表达的重组蛋白分子质量约为35 ku,主要以包涵体形式存在。间接ELISA试验结果显示,纯化后的GAstV-1 VP27多克隆抗体效价高达1∶9 841 500,纯度高于85%。IFA结果显示,GAstV-1 VP27多克隆抗体可特异性识别GAstV-1,且与GAstV-2无交叉反应。临床病料组织检测结果显示,GAstV-1核酸阳性的病料组织均可出现特异性荧光,而GAstV-2核酸阳性且GAstV-1核酸阴性的病料组织未出现荧光。【结论】本研究获得了高效价且可特异性识别GAstV-1(与GAstV-2无交叉反应)的VP27多克隆抗体,为建立鉴别诊断GAstV-1的抗原免疫检测技术奠定了基础。

Long non-coding RNA VPS9D1-AS1对乳腺癌细胞恶性行为的影响和机制

目的探讨长链非编码RNA(LncRNA)VPS9D1-AS1对乳腺癌细胞恶性行为的影响和机制。方法收集49例接受手术的乳腺癌患者的乳腺癌组织和癌旁组织,体外培养人正常乳腺上皮细胞MCF-10A和乳腺癌细胞系MCF-7、T47D、BT549,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-4695-5p及LncRNA VPS9D1-AS1表达水平;选择MCF-7细胞分别转染si-NC、si-LncRNA VPS9D1-AS1、pcDNA、pcDNA-LncRNA VPS9D1-AS1、miR-NC、miR-4695-5p模拟物、anti-miR-NC+si-LncRNA VPS9D1-AS1、anti-miR-4695-5p+si-LncRNA VPS9D1-AS1,采用RT-qPCR检测MCF-7细胞中LncRNA VPS9D1-AS1、miR-4695-5p表达水平,CCK-8和Transwell实验评估细胞存活率和迁移侵袭数,蛋白质印记法检测IL-6、MMP2、MMP9蛋白水平;双荧光素酶实验证实LncRNA VPS9D1-AS1与miR-4695-5p的靶向关系。结果LncRNA VPS9D1-AS1在乳腺癌组织和MCF-7、T47D、BT549细胞系中表达上调(P<0.05),miR-4695-5p表达下调(P<0.05),MCF-7细胞中LncRNA VPS9D1-AS1、miR-4695-5p变化最明显,选择MCF-7细胞进行后续实验;转染LncRNA VPS9D1-AS1后,MCF-7细胞存活率、细胞迁移和侵袭数以及IL-6、MMP2、MMP9蛋白水平降低(P<0.05);转染miR-4695-5p模拟物后,miR-4695-5p表达升高(P<0.05),MCF-7细胞存活率、细胞迁移和侵袭数及IL-6、MMP2、MMP9蛋白水平降低(P<0.05);转染pcDNA-LncRNA VPS9D1-AS1后,MCF-7细胞中miR-4695-5p表达下降(P<0.05);共转染anti-miR-4695-5p+si-LncRNA VPS9D1-AS1后,MCF-7细胞存活率、迁移数和侵袭数及IL-6、MMP2、MMP9蛋白水平升高(P<0.05)。结论干扰LncRNA VPS9D1-AS1通过靶向上调miR-4695-5p抑制促炎因子IL-6表达,进而抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移及侵袭。

肠道病毒C组96型VP1蛋白线性B细胞表位筛选与鉴定

目的鉴定肠道病毒C组96型(enterovirus C96,EV-C96)VP1蛋白的线性B细胞表位。方法采用IEDB网站提供的在线分析工具分析、预测EV-C96 VP1蛋白的线性B细胞表位,结合其二级结构、β-转角、抗原性、亲水性等多项参数,筛选出优势候选表位;应用间接ELISA法检测候选表位与EV-C96免疫血清的反应性以及与21种其他常见手足口病病原血清的交叉反应性;应用微量中和试验测定表位抗体的中和效价;采用序列比对分析表位的序列保守性;应用结构对齐分析表位的结构特异性。结果通过生物信息学筛选出EVC96 VP1蛋白7个候选表位(P1~P7);ELISA法检测发现P7(氨基酸序列位置为282~304)与EV-C96多克隆抗体有强反应性,与其他常见EV多克隆抗体不发生明显反应;微量中和试验显示,P7抗体的中和效价低于1∶2;序列及结构分析结果显示,P7的氨基酸序列在EV-C96型内具有较高保守性,与其他EV相应位点氨基酸序列的结构有明显差异。结论P7表位为EV-C96特异的非中和性B细胞表位,可作为开发EV-C96检测试剂盒的候选抗原表位。

鸭病毒性肝炎病毒VP1基因表达及其抗体检测ELISA方法的建立

【目的】研究DHV VP1基因在大肠杆菌中的表达,并以纯化的重组蛋白为抗原建立鸭病毒性肝炎抗体检测ELISA方法。【方法】采用RT-PCR技术,扩增VP1基因,与pMD18-T载体进行连接,构建DHV VP1基因克隆重组质粒。然后定向插入到pET-32a(+)表达载体,筛选原核表达载体pET-32a-VP1,进行ITPG诱导表达分析。以纯化的重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法并初步应用于临床。【结果】DHV VP1基因可在大肠杆菌中稳定、高效地表达。Western blot检测表明,表达的重组蛋白能与鸭肝炎阳性血清发生特异性反应。确定间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为5μg/孔,血清最佳稀释度为1∶100,临界值为OD450值≥0.302,建立的ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。通过对80份血清样品的检测表明,该方法与中和试验的符合率为97.5%,初步临床应用结果表明该方法可用于雏鸭母源抗体和免疫后抗体的消长变化的检测。【结论】以大肠杆菌表达的DHV VP1重组蛋白为抗原建立的间接ELISA方法可用于鸭病毒性肝炎抗体的检测。

猪O型口蹄疫病毒强弱毒株VP_1基因的克隆与序列分析

本研究根据口蹄疫病毒 (FMDV)VP1基因的序列 ,设计并合成了 1对用于扩增整个VP1基因的引物 (5P、P6 )。从细胞培养液或组织中提取总RNA ,通过PT_PCR扩增 ,从F2 9株、O3I3株和T5 0 9株中均获得了 1条约 740bp的DNA电泳带。将PCR产物双酶切后电泳回收 ,插入到相应双酶切的pUC18质粒中 ,获得了重组质粒。通过PCR鉴定 ,证明重组质粒pUCVP1/F2 9、pUCVP1/O313、pUCVP1/T5 0 9均插入了VP1基因。对上述 3个重组质粒进行测序后分析 ,F2 9强毒株与O3I3、T5 0 9弱毒株相比 ,其核苷酸序列同源性分别为 98.75 %和 99.0 6 % ;因F2 9株核苷酸发生 3个碱基缺失与 1个碱基替换 ,故推导的氨基酸序列同源性分别仅为 44 .13%和 41.32 % ;而T5 0 9株与O3I3株相比 ,其核苷酸、氨基酸序列同源性分别为 99.37%和 95 .31%。通过序列分析发现 ,本研究的 3个毒株与国内大多数毒株 (包括 1997年台湾暴发FMDV所分离的毒株 ,除O/A/ 5 8株外 )均属于同一基因型 ,核苷酸序列同源性为 85 %～ 94% ;而与国外毒株相比 ,属不同的基因型 ,核苷酸序列同源性仅为 81%～ 82 %。其推导的氨基酸序列 ,除F2 9株与O/HK/ 93株及 1997年台湾暴发FMDV分离的少数毒株的氨基酸序列同源性仅为 45 %～ 6 3%外 ,本研究的

新疆小麦品种穗发芽Vp-1基因等位变异的分布

为了给新疆小麦抗穗发芽育种提供理论依据和品种资源,利用Vp-1基因的功能标记Vp1 B3检测了252份新疆小麦品种。结果表明,新疆小麦品种中Vp-1 Ba(感穗发芽)、Vp-1 Bb(抗穗发芽)和Vp-1 Bc(抗穗发芽)基因型的频率分别为54.8%、3.2%和42.0%,以Vp-1 Ba基因型为主。其中,冬小麦中抗、感穗发芽基因型的频率分别为39.2%和60.8%,以感穗发芽基因型为主;而春小麦中抗、感穗发芽基因型的频率分别为55.3%和44.7%,抗穗发芽基因型频率较高。农家品种、引进品种和育成品种中Vp-1 Ba、Vp-1 Bb和Vp-1 Bc基因型的分布频率存在明显差异,依次为80.4%、0.0%和19.6%,39.5%、2.6%和57.9%,54.6%、4.6%和40.8%,农家品种和育成品种都以感穗发芽基因型为主。本研究结果还表明,STS标记Vp1 B3检测方法简单、稳定性好,将其与整穗发芽法和发芽指数法结合使用,有助于提高选择效率。

猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体间接ELISA方法的建立

将口蹄疫病毒(FMDV)的VP1基因,通过pPROex-HT表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,获得大小为31ku的融合蛋白,Westernblot检测证实表达的该蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原建立了猪FMDVVP1蛋白间接ELISA检测方法。通过对80份田间血清样品的检测表明,该方法与FMDV液相阻断ELISA(国标试剂盒)的总符合率为96.25%,表明建立的VP1蛋白间接ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。