牦牛轮状病毒VP6基因序列分析及RT-PCR检测方法的建立与应用

轮状病毒(rotavirus,RV)VP6基因是RV的主要分子检测靶点,但该基因的点突变会影响RV的分子检测。本试验的目的是在研究牦牛RVVP6基因遗传变异的基础上,建立检测牦牛RV的RT-PCR方法并应用于临床样本检测。采用Prime 5.0设计引物,从30个牦牛腹泻样本中扩增得到14个位于931—1 338bp牦牛RVVP6基因片段。序列分析结果发现,与牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRV)相比,牦牛RVVP6基因在931—1 110bp间出现多处点突变,而在1 100—1 338bp之间序列高度保守。据此设计检测引物,成功建立了检测牦牛RV的RTPCR方法,具有良好的特异性和稳定性,只扩增出牦牛RV及BRV的特异片段,对其他无关病原无扩增;检测下限为0.45pg·μL^(-1),灵敏性较好。所建立方法对牦牛RV的检出率明显优于现有检测BRV的RT-PCR方法,为牦牛RV病的诊断和流行病学调查提供了可靠的方法;对BRV的检出也与其他方法具有很好的符合率,也可以用于BRV的检测。对234份犊牦牛腹泻粪便样本的RV检出率:西藏为60.00%(36/60)、青海为95.00%(57/60);四川为85.19%(46/54);云南为90.00%(54/60),证明牦牛RV感染是当前导致犊牦牛腹泻的重要原因。

草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白与大肠杆菌LTB亚基植物融合表达载体的构建

根据GenBank中草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)VP6蛋白的全基因序列(AF403394)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的基因序列(M17874),设计并合成特异性引物,从感染草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾细胞(CIK)中提取病毒核酸作为模板,进行RT-PCR扩增,得到约1.3 kb的GCRV VP6基因读码框片段,同时提取大肠杆菌(Escherichia coli)H44815全基因组作为模板,进行PCR扩增得到约370 bp的LTB基因读码框片段。将获得的2个目的片段分别克隆到pCR2.1载体上,经酶切、PCR扩增检测和序列测定确认后,将其克隆到携带绿色荧光蛋白标记的植物表达载体pCAMBIA1302上,成功构建了可将草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白、大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)、绿色荧光蛋白(GFP)融合表达的植物载体pCAMBIA 1302-LTB-VP6。本研究旨为草鱼出血病可饲化转基因植物疫苗研制奠定基础。

猪轮状病毒地方株JL94株VP6基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以猪轮状病毒地方分离株JL94株病毒核酸为模板,通过RT-PCR扩增内衣壳蛋白基因VP6cDNA,将其插入克隆载体质粒pMD18-T,并进行测序。从T载体上将VP6基因亚克隆到表达载体质粒pET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并利用Ni2+金属螯合亲合层析纯化融合蛋白。结果表明,VP6基因全长1356bp,并在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量可占菌体蛋白的26.5%,在表达的蛋白中,除45ku主要蛋白外,还有几条分子量较小的蛋白表达出来,这些融合蛋白经纯化后均具有良好的反应特异性。

转猪轮状病毒VP6基因烟草植物的获得

根据G enB ank中轮状病毒VP 6序列设计1对引物,从pGEM-T-VP 6质粒中扩增VP 6 PCR产物。将VP 6克隆到PB I121质粒中,转化根癌农杆菌LBA 4404,挑取阳性菌落的质粒进行酶切鉴定。用叶盘法转化烟草,获得再生苗,用RT-PCR、PCR和PCR-sou thern杂交方法进行鉴定,结果表明,VP 6基因已成功地转入烟草中。

草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建

以据草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP6蛋白的全基因序列(GeneBank AF403394)为模板,采用RT-PCR构建了草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建。结果显示:实验构建的pCR 2.1-VP6重组质粒含有NcoⅠ和BglⅡ酶切位点;pCR 2.1-VP6重组质粒经PCR扩增和测序显示含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因读码框片段。将目的片段VP6酶切、克隆到携带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物表达载体pCAMBIA1302中,再经酶切、PCR扩增和序列测定显示,pCAMBIA1302-VP6含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因片段,说明已插入植物表达载体pCAMBIA1302绿色荧光蛋白基因前,成功构建了融合表达草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白和绿色荧光蛋白的植物表达载体pCAMBIA1302-VP6。

草鱼出血病病毒vp6核酸疫苗的免疫效果评估

为了评估草鱼出血病病毒(GCRV)vp6基因核酸疫苗的免疫效果,将vp6基因克隆进pFastBacTMDual载体杆状病毒的多角体蛋白(Ph)启动子下游,同时将团头鲂(Megalobrama amblycephala)β-actin启动子控制的vp6基因克隆进杆状病毒的P10启动子下游,获核酸疫苗载体pFastBac-FA-VP6-ph-VP6。按每尾分别注射疫苗载体10、30、60μg的剂量免疫草鱼(Ctenopharyngodon idellus)(体长14～20 cm,体质量60～120 g),同设pFastBacTMDual载体(30μg/尾)阴性对照组及空白对照组(0.4 mL/尾无菌水)。于免疫后不同时间通过RT-PCR检测免疫鱼体中vp6基因的表达,并于免疫后第14、21、28、49、70天分别通过间接凝集反应检测血液中的抗体水平,并在免疫第21天感染GCRV评估免疫保护效果。结果显示,核酸疫苗免疫草鱼后,各免疫组均有抗体产生,抗体效价在免疫后第28天达到最高;攻毒后每尾注射疫苗载体10、30、60μg组的死亡率分别为0%、0%、5%,pFastBacTMDual载体对照组和空白对照组分别为30%和100%。表明构建的核酸疫苗对草鱼病毒性出血病有较好的免疫保护效果。

猪轮状病毒VP6基因的原核表达载体构建和表达

根据已报道的猪轮状病毒VP6基因序列设计了2对引物,利用pGEM-T-Easy-VP6重组质粒为模板,经PCR扩增获得了1 194 bp的产物。将扩增片段分别插入到pET5α和pGEX-4T-2构建表达载体,并分别在大肠杆菌BL21(DE3)Plyss和ER2566中表达。结果表明:成功构建了重组质粒,而且该片段在大肠杆菌中也成功表达,获得了大小为44 kD的蛋白。

转猪轮状病毒VP6基因烟草的杂交检测

为了确定VP6基因是否已整合到烟草的基因组中,通过PCR-Southern、Dot-Blot和Western-Blot方法检测转基因烟草,结果表明,VP6基因已经成功地转化到烟草中。

轮状病毒的LLR疫苗株全基因组克隆及结构蛋白VP6基因遗传特征

目的 了解轮状病毒（RV）的LLR疫苗株全基因组基因和蛋白特征、完善关键基因遗传稳定性研究,为疫苗的质量控制和研发提供依据.方法 将LLR株毒种第38代在原代牛肾细胞上连续传至49代,提取第38、43、44、49代病毒RNA.通过RT-PCR方法扩增LLR株（38代）全基因组11个dsRNA片段和传代病毒VP6基因,分别将其克隆到pGEM-T载体中,进行序列测定与分析.结果 LLR株全基因组11条RNA,由18 498个核苷酸组成,共编码5 796个氨基酸;全基因组研究表明,所克隆的LLR株属于G10P[15]/NSP4[A]/SG Ⅰ基因型.LLR株VP6基因全长1 356 bp,含编码397个氨基酸的单一的开放读码框架（ORF）.各代次病毒的VP6基因核苷酸与推导的氨基酸变化完全一致,与GenBank中LLR参考株（L11595）同源性分别为99.9％和99.7％.与16株SG Ⅰ亚群RV代表株之间,核苷酸与推导的氨基酸序列同源性分别为84.0％ ～ 99.7％和97.0％ ～ 99.2％;与不同亚群RV代表株之间,VP6基因核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为77.7％ ～ 82.2％和92.2％ ～93.5％;LLR株各代病毒VP6基因核苷酸、氨基酸序列高度保守,各关键功能区未发生变异.结论 LLR疫苗株关键基因遗传特性稳定,为在分子水平保证LLR株毒种及其生产疫苗的安全性提供了依据;其全基因组克隆,为进一步研究RV生物学、免疫学和确定该病毒的分类学地位提供了科学依据.

A群猪轮状病毒JS株VP6基因序列分析

参考GenBank中发表PRVOSU毒株VP6序列ORF两端保守区，设计1对特异引物，以PRVJS株反转录cDNA为模板，通过PCR方法获得约1．3kb的基因片段，并克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。测序结果表明：获得了VP6的1320bp全基因序列；将其ORF与国内外9株PRVVP6基因的ORF进行核苷酸和氨基酸同源性比较，核苷酸同源性在77．1％～91．1％之间，氨基酸的同源性在89．7％～99．5％之间；在氨基酸系统发育进化树中，JS毒株与A131、OSU、CN86毒株亲缘关系较近．为一个进化群。

猪A组轮状病毒Vp6基因与乳酸菌非抗性表达载体的重组及在大肠杆菌中的表达

以猪A组轮状病毒mRNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,扩增了1194bp的Vp6基因,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至克隆载体pGEM-TVector中,构建克隆质粒pGEM-T-Vp6。用SacⅠ和KpnⅠ双酶切pGEM-T-Vp6和以胸苷酸合成酶基因(thymidylate synthase,thyA)为选择压力的非抗生素抗性的穿梭表达载体pW425t,并将纯化的Vp6基因亚克隆至表达载体pW425t中,构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425t-Vp6。将pW425t-Vp6转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E.coliX13中,经生长功能弥补筛选阳性克隆,通过SDS-PAGE分析,可见约44.88kD的融合蛋白。由Western blot分析,表明该蛋白具有与轮状病毒多克隆抗体的反应原性,从而为pW425t-Vp6在乳酸菌受体菌株中表达提供理论基础和实验依据。

轮状病毒新型VP6基因的拼接合成和序列测定

目的设计获得轮状病毒(RV)新型VP6基因.方法本研究在前期工作的基础上,对RVVP6基因的优化合成方法进行了探索研究.我们应用改良的嵌套式PCR策略,通过逐步拼接法对RVVP6基因进行了优化改造.结果成功地合成了优化的RVVP6基因cDNA序列,该序列长约1220bp,(G+C)含量达55%.结论与野生型RVVP6基因相比,优化合成的RVVP6基因(G+C)含量提高了约20%,这一工作为新型高效口服RV基因工程疫苗的深入研究奠定了基础.

猪A组轮状病毒HN2019-01株的分离鉴定及VP6基因序列分析

为了解猪轮状病毒(RV)在河南省的流行情况及其分子遗传特征,利用反转录PCR方法,从河南某猪场腹泻样品中扩增得到RV特异性核酸片段,并将腹泻样品利用MA-104细胞进行RV的分离和传代,将分离得到的RV命名为RVA/Pig-wt/HN2019-01。对分离毒株VP6基因片段的序列测定及生物信息学分析结果表明,分离毒株VP6核苷酸序列与猪源毒株西南株-1C(SWU-1C)相似性最高,病毒分类上同属I5亚群。VP6蛋白全长397个氨基酸,存在4个N糖基化位点和18个潜在磷酸化位点,二级结构主要由α-螺旋组成,三级空间结构与牛轮状病毒RF株VP6蛋白高度相似,且在2个细胞毒性T淋巴细胞(CTL)抗原表位区域的氨基酸序列保守。

含牛轮状病毒VP6的嵌合型HBcAg颗粒抗原的制备及其免疫原性分析

本研究将编码牛轮状病毒VP6蛋白的部分基因插入到HBcAg的免疫显性区的基因中,构建了pET32a-HBcAg-VP6原核表达载体,并将其转化至大肠杆菌BL21中进行表达。重组蛋白经纯化和Western blot鉴定后,通过透射电镜观察重组蛋白HBc-VP6是否形成病毒样颗粒。以重组蛋白HBc-VP6皮下注射BALB/c小鼠,对免疫原性进行初步评价。结果显示:重组蛋白HBc-VP6在BL21中主要以沉淀的形式表达,经纯化、复性后的重组蛋白HBc-VP6能够自我折叠装配成病毒样颗粒结构,能够与BRV阳性血清发生特异性反应。重组蛋白HBc-VP6能够刺激小鼠产生抗BRV特异性抗体,同时可以产生相关的Th1型和Th2型细胞因子,试验结果证实,本研究成功制备了含VP6和HBcAg的重组蛋白HBc-VP6,并在小鼠模型中初步评价了其免疫原性,为今后牛轮状病毒疫苗的研制提供了新的思路。

基于恒温隔绝式荧光PCR技术现场检测牛轮状病毒方法的建立及应用

轮状病毒(rotavirus,RV)是犊牛腹泻的重要病因,笔者旨在建立基于恒温隔绝PCR(insulated isothermal PCR,iiPCR)技术现场检测牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRV)的方法。根据BRV和牦牛RVVP6基因序列,设计合成引物和探针,通过优化反应体系,配合商品化PetNAD核酸萃取试剂盒,建立了检测BRV和牦牛RV的iiPCR方法。结果显示该方法只能检出BRV和牦牛RV,不能检出牛冠状病毒、牛星状病毒、牛病毒性腹泻-黏膜病病毒、牛大肠杆菌、牛沙门菌、牛艾美尔球虫、牛瑞氏隐孢子虫等无关病原;检测下限为96.6copies·μL-1,重复性好;对30份牛腹泻样本和30份牦牛腹泻样本的检测结果表明,本方法对BRV的检出率是33.33%,对牦牛RV的检出率为73.33%,与文献报道的检测BRV和牦牛RV的方法的符合率分别为100%;对2016年四川阿坝藏羌自治州14个牧场的88份犊牦牛腹泻样本RV的检测结果显示RV核酸阳性检出率为98.86%。本研究建立的BRV iiPCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,既可用于BRV检测,又可用于牦牛RV的检测;从核酸提取到报告检测结果仅需1h,操作方便,可现场使用,为BRV的现场快速诊断提供有力的工具。

猪轮状病毒JL94中国分离株衣壳蛋白基因的分析

根据GenBank发表的猪轮状病毒衣壳蛋白vp4基因、vp6基因和vp7基因保守序列,设计合成3对引物,分别扩增猪轮状病毒中国分离株JL94株的此3段基因并进行序列分析。结果表明,JL94株vp4基因与国外分离株CRW-8株、OSU株、Gottfried株、4F株和4S株的VP4氨基酸同源性分别为97.16％、95％、71.88％、73.45％和70.88％;JL94株vp6与CRW-8株、OSU株、Gottfried株、4F株和4S株的VP6氨基酸同源性分别为96.98％、97.48％、93.20％、97.48％和93％;JL94株vp7基因与CRW-8株、OSU株、Gottfried株、4F株和4S株的VP7氨基酸同源性分别为98％、99.90％、75.40％、84.66％和80％。可见JL94株同CRW-8株、OSU株同源性更高些;vp4和vp7基因在同型间高度保守而不同型间差距较大,vp6基因在同群和非同群间差别不是很明显。同时可以判定JL94属于A群Ⅰ亚群G5P7血清型PRV。研究猪轮状病毒中国分离株JL94株衣壳蛋白基因的特征,为研制高效抗病毒疫苗奠定基础。

草鱼呼肠孤病毒TaqManreal-time PCR检测方法的建立

利用RT-PCR技术扩增出草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP6蛋白编码区长度为1 250 bp的片段,克隆到pEGFP-N1载体上,构建重组质粒pEGFP-N1-VP6。经PCR鉴定确认正确后,以10倍梯度稀释pEGFP-N1-VP6重组质粒,作为标准模板进行TaqMan real-time PCR扩增,制作标准曲线,建立了草鱼呼肠孤病毒的荧光定量PCR检测方法。检测结果显示,标准曲线的相关系数(R2)达到0.998 09,斜率为-3.373;对初始模板定量检测的范围为1×101～1×106copies/μL;特异性试验结果表明,该方法可特异性地检测出草鱼呼肠孤病毒,而对鲤春病毒血症病毒(SVCV)、传染性造血器官坏死症病毒(IHNV)无检测信号。本研究建立的草鱼呼肠孤病毒TaqMan real-time PCR方法灵敏度高、特异性强,可进行定量分析,对草鱼出血病快速诊断与病毒病原定量检测有重要意义。

仔猪感染猪轮状病毒的鉴定及基因分析

为弄清2013年年初上海某猪场发生的仔猪腹泻疫情病因,本研究随机采集发病猪场的仔猪腹泻样品9份,利用RT-PCR方法对采集样品进行病原检测。结果显示,9份临床样品中有4份为猪轮状病毒阳性,而猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒均为阴性。根据GenBank公布的猪轮状病毒参考株序列设计两对引物,对其中阳性样品的VP6和VP7基因进行RT-PCR扩增、基因克隆和序列测定分析。结果显示,4份阳性样品的VP6基因大小为1356 bp,VP7基因大小为1100 bp;序列分析结果显示,VP6基因与A群代表株OSU的氨基酸同源性为64.1%~87.0%,与代表株Gottfriend的氨基酸同源性为26.3%~60.8%;VP7基因与不同G型代表株的氨基酸同源性为71.8%~97.3%。根据上述结果分析,我们推测引起此次仔猪腹泻疫情中的主要病原是由属于A群G9血清型的猪轮状病毒引起,本研究为此次仔猪腹泻疫情的诊断提供了依据。

猪A群轮状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据近5年来GenBank发布的猪A群轮状病毒(RVA)VP6基因序列,针对保守区域设计1对特异性引物,优化反应体系及条件,建立了TB Green实时荧光定量PCR方法。该方法在模板浓度为1.06×10^8 copies/μL~1.06×10^2 copies/μL范围内线性关系良好,相关系数R^2=0.9975,最低检出浓度为106 copies/μL;批内及批间变异系数小于2%。利用该方法对猪RVA亚型G3、G4、G5、G9和G26检测均为阳性,而对猪常见病原(猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪呼肠孤病毒MRV、猪捷申病毒、巴氏杆菌、链球菌以及猪等孢球虫)检测均为阴性。对91份临床腹泻样品进行检测,研究建立的猪RVA TB Green实时荧光定量PCR检出率(43.96%,40/91)高于已报道的猪RVA SYBR Green荧光定量PCR(42.86%,39/91)和国家标准RVA的普通RT-PCR(12.09%,11/91),且符合率为100%。建立的RVA荧光定量PCR检测方法为流行病学调查和早期诊断提供了技术支撑。

牛轮状病毒VP6蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的原核表达牛轮状病毒(rotavirus,RV)VP6蛋白,并制备其多克隆抗体。方法根据Gen Bank中登录的牛RV UK株VP6基因序列(X53667.1)设计一对特异性引物,RT-PCR扩增牛RV UK株VP6全长编码区片段,克隆至载体p ET-28a,构建重组表达质粒p ET-28a-Bo-RV-VP6,转染至E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析。将重组蛋白与弗氏佐剂混合后免疫豚鼠,共免疫3次,每次间隔2周,末次免疫后2周,经心脏采血,分离血清,制备VP6多克隆抗体,Western blot法检测其与牛RV的反应原性。结果经双酶切和测序鉴定,重组表达质粒p ET-28a-Bo-RV-VP6构建正确。重组蛋白以包涵体的形式表达,表达产物分别为43 000、34 000、27 000和15 000 4种不同相对分子质量的重组蛋白,纯化后纯度可达95%以上,可与牛RV阳性血清发生特异性反应。制备的VP6蛋白多克隆抗体效价>1∶7 000,且可识别RV天然VP6蛋白。结论原核表达了牛RV VP6蛋白,并制备了抗VP6多克隆抗体,为后续RV疫苗效力评价及RV侵入机理等方面的研究奠定了基础。