轮状病毒VP7-U基因在胡萝卜中表达的免疫原性分析

轮状病毒是一种危害人类健康的腹泻病毒,缺乏可控性药物。将优化部分密码子的轮状病毒VP7基因(VP7-U基因)整合到胡萝卜(Daucus carota)植株中,并利用PCR、Western blot、ELISA等方法检测转VP7-U基因胡萝卜的蛋白表达情况。然后利用不同浓度的阳性VP7-U胡萝卜蛋白灌服小鼠,以灌服正常胡萝卜植株蛋白的小鼠为阴性对照,以灌服阳性细菌蛋白的小鼠为阳性对照,灌服4次后利用ELISA方法检测小鼠体内的IgG含量。结果表明,转VP7-U基因的胡萝卜植株在蛋白水平上有目的抗原的表达并且其表达含量有一定的增加。灌服阳性胡萝卜蛋白的小鼠IgG含量高于灌服阴性胡萝卜蛋白的小鼠,但低于灌服阳性细菌蛋白的小鼠。然而统计分析表明,阳性小鼠同阴性小鼠体内的IgG含量差异不显著。转基因胡萝卜口服疫苗的发展还有很多困难,需进一步深入研究。

A群猪轮状病毒VP7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

试验旨在制备A群G11血清型猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)VP7蛋白的单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性。将A群G11血清型PoRVVP7基因克隆至pGEX-6P-1载体,然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,IPTG诱导表达GST-VP7融合蛋白。分离纯化融合蛋白GST-VP7并免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,利用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞并进行有限稀释法克隆化筛选。经3次筛选,最终得到1株能与GST-VP7蛋白反应的特异性、稳定分泌抗体的阳性细胞克隆。Western blotting鉴定结果显示该单克隆抗体具有良好的免疫原性及特异性;MTT法中和试验结果显示其具有中和活性;分泌的单克隆抗体亚型为IgG2b。本试验结果表明A群PoRV VP7蛋白在大肠杆菌中成功表达且制备了单克隆抗体,可用于PoRV VP7蛋白结构和功能的研究,也为猪轮状病毒病的预防、诊断和治疗等研究奠定基础。

蓝舌病病毒Z1株VP7基因的克隆及序列分析

用RT PCR扩增我国蓝舌病毒Z1株的 VP7基因 ,直接将其克隆至 pGEM T载体中 ,用限制性内切酶EcoRⅠ分析经蓝 /白斑筛选和PCR鉴定的重组质粒 ,用DIG标记克隆片段制成探针与病毒基因组进行Northernblot杂交 ,证明插入片段为BTVVP 7基因特异性片段。采用Sanger双脱氧终止法测定cDNA片段的核苷酸序列 ,将这一序列与国外已发表的 9株蓝舌病毒及相关的环状病毒的VP 7基因进行了比较分析 ,结果表明 :国内BTVZ1株的VP 7基因的核苷酸序列与上述 9个毒株的同源性在 71 4%～ 98 7%之间 ,与USABTV 10株的同源性最高 ,与AUSBTV 15株的同源性最低。该研究对于我国蓝舌病基因工程疫苗的研制及对该病分子流行病学的调查有着重要意义。

蓝舌病病毒VP7基因的原核表达及反应原性分析

为获得蓝舌病病毒(BTV)VP7基因原核表达蛋白并检测其生物学活性,根据Genbank登录的BTV VP7基因,设计1对引物,运用RT-PCR扩增技术获得BTV VP7目的片段,然后定向克隆到pPROEXHTb原核表达载体上,再转化重组质粒pPROEXHTb-VP7到BL21感受态细胞,IPTG诱导,表达产物纯化,进行SDS-PAGE鉴定及Western-blot反应原性分析.结果表明:表达的VP7目的蛋白大小为35ku,Western-blot分析表明纯化后的蛋白可以与BTV单克隆抗体发生特异性反应.