兔轮状病毒VP8*蛋白原核表达、基因序列及蛋白特性分析

为深入研究兔轮状病毒VP8*蛋白的结构和功能,本研究利用生物信息学软件DNAStar对兔轮状病毒Z3171株的VP8*基因序列进行核苷酸和氨基酸同源性分析,运用生物信息学方法对该蛋白的理化性质、亲/疏水性、磷酸化及糖基化位点、结构域、中和表位及三维结构等进行了分析。设计合成引物,采用PCR方法扩增VP8*蛋白编码基因,并将目的片段克隆到pET28a(+)原核表达载体,经体外原核表达,采用亲和层析纯化获得VP8*目的蛋白。结果显示:Z3171株的VP8*基因与国内外参考序列对比,核苷酸序列同源性为32.8%~90.3%,氨基酸序列同源性为39.2%~91.9%。生物信息学分析显示该蛋白理化性质稳定,无跨膜结构域,不含有信号肽,主要定位于细胞骨架中。其中1个中和表位区域内有2个氨基酸插入,该区域三维构象亦发生变化。PCR扩增的VP8*基因条带大小为558 bp,经测序与目的基因完全一致;经SDS-PAGE和Western blot鉴定,重组VP8*蛋白以可溶形式表达,血凝性试验结果表明该蛋白无血凝性。本研究为VP8*免疫原性分析及研制兔轮状病毒疫苗提供了参考。

牛传染性鼻气管炎病毒VP8蛋白表位鉴定

为鉴定牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的VP8蛋白抗原表位,本研究采用超速离心纯化的IBRV免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术获得了2株针对IBRV的VP8蛋白的单克隆抗体(MAb),命名为1F5和3C2。MAb1F5和3C2的腹水效价均大于1:4×10~5,亚型均为IgG1/κ。间接免疫荧光试验表明,2株MAb与IBRV呈特异性反应。利用肽扫描技术对MAb进行抗原表位鉴定,结果表明MAb3C2的抗原表位为^(138)PHRSLLERTA^(147),MAb1F5的抗原表位为^(183)GGGQEPG^(189),2株MAb针对的抗原表位在不同的IBRV分离株中高度保守。本研究为VP8蛋白的结构与功能的进一步分析及IBRV的检测奠定了基础。

一种基于VP8编码的Webp图片压缩格式研究

Webp是一种基于VP8编码的新型图片压缩技术,采用了Fancy采样算法和针对同一图片的不同区域分别压缩等技术。对比Web上最为流行的JPEG图片格式,在保证图片质量基本不变的情况下保证更高的压缩比。采用PSNR和SSIM对Webp和JPEG图片压缩格式进行对比测试,并对图片进行数据压缩和还原测试。实验结果表明,Webp图片压缩格式具有很高的实用价值。

猪轮状病毒重组VP8*蛋白的原核表达及免疫原性分析

为了分析原核表达的猪轮状病毒（PRV）Gottfried株截短的VP8＊（△VP8＊aa64—223）重组蛋白的免疫原性，通过构建原核表达载体pET-28a—Gotffried—△VP8＊（aa64—223），转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，IPTG诱导表达、经SDS—PAGE和Westernblotting检测，并纯化后，肌肉免疫Balb／c小鼠，证明重组蛋白相对分子质量约25．0kDa，以包涵体和可溶性两种形式存在，纯化的重组蛋白纯度在95％以上，可溶性蛋白产量可达14～15mg·L-1。ELISA方法检测表明该重组蛋白可以诱导高滴度的特异性抗体，证明其具有良好的免疫原性，为进一步研制PRV亚单位疫苗及建立ELISA诊断方法奠定基础。

海藻酸钠-壳聚糖P-VP8~*IgY微胶囊的制备及其释放性能

目的在前期试验成功制备纯化出抗诺如和轮状病毒的双价特异性P-VP8~*IgY基础上,本研究作者制备海藻酸钠-壳聚糖P-VP8~*IgY微胶囊并优化最佳制备工艺。方法以海藻酸钠-壳聚糖为微胶囊囊材,采用复凝聚技术"一步法"制备P-VP8~*IgY微胶囊。以微胶囊的成囊效果和包封率为评价指标,通过单因素分析和L9(34)正交试验优化微胶囊的最佳制备工艺。并运用SDS-PAGE和ELISA法评价海藻酸钠-壳聚糖P-VP8~*IgY微胶囊的释放性能和生物学活性。结果海藻酸钠-壳聚糖P-VP8~*IgY微胶囊的最佳制备工艺条件为:海藻酸钠浓度为3. 0%、壳聚糖浓度为0. 4%、氯化钙浓度为2%(均为质量分数)、壳聚糖与氯化钙溶液(成囊液)的p H值为5. 5,IgY投药量为10 g·L-1。制备的海藻酸钠-壳聚糖P-VP8~*IgY微胶囊大部分呈规则球形,表面较为光滑圆整,包封率可达到85%。制备的微胶囊在胃液2 h后的释放率为7%,肠液6 h后的释放率高达86%,且生物活性良好。结论本工艺制备的海藻酸钠-壳聚糖P-VP8~*IgY微胶囊能够保护特异性P-VP8~*IgY不被胃酸环境破坏,具有较好的缓释作用。

P[1]型A群牛轮状病毒VP8重组蛋白的表达与免疫原性研究

【目的】利用原核表达系统表达P[1]型A群牛轮状病毒(BRVA)VP8重组蛋白,并评价其反应原性与免疫原性。【方法】根据国内流行毒株RVA/Cow-tc/CHN/SDA2/2018/G6P[1]VP8基因序列(GenBank登录号:MN937517)进行密码子偏好性优化,构建P[1]型BRVA VP8大肠杆菌原核表达系统,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析重组蛋白表达形式。镍琼脂糖亲和层析纯化重组蛋白,Western blotting鉴定重组蛋白与兔抗G6P[1]型BRVA血清特异性结合能力,并将P[1]型BRVA VP8重组蛋白免疫兔,首免后2周加强免疫1次,共免疫2次。分别用间接ELISA方法与中和试验评价其免疫原性。【结果】本研究成功构建P[1]型BRVA VP8重组蛋白的原核表达系统;SDS-PAGE结果显示,高效表达大小为20 ku的P[1]型BRVA VP8重组蛋白,以可溶形式存在;Western blotting结果显示,P[1]型BRVA VP8重组蛋白能与兔抗G6P[1]型BRVA血清特异性结合;间接ELISA结果显示,P[1]型BRVA VP8重组蛋白亚单位疫苗能诱导兔产生抗体,兔首免1周后抗体开始出现并迅速上升,于第3周达到高峰,至第5周仍维持在较高水平;中和试验结果显示,第2次免疫后抗体最高的兔血清对G6P[1]型和G8P[1]型BRVA的中和效价分别为1∶17783和1∶64。【结论】本研究成功构建原核表达系统表达P[1]型BRVA VP8重组蛋白,并证实其具有良好的反应原性及免疫原性,为研制BRVA亚单位疫苗奠定基础。

轮状病毒VP4蛋白酶切片段VP5*、VP8*在原核系统中的表达

目的克隆表达轮状病毒结构蛋白VP4酶切片段VP5*、VP8*。方法以猴轮状病毒SA11株细胞培养物提取总RNA为模板,经RT-PCR方法获得VP5*、VP8*全长基因片段cDNA,将其重组于pET-30 a表达载体,转化大肠杆菌BL21(plyss),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物做SDS-PAGE和Western-blotting检测,目的产物用镍柱纯化。结果①重组载体在IPTG诱导下,工程菌表达的两个目的蛋白主要以包涵体形式存在;②SDS-PAGE检测表达产物与目的蛋白大小一致,VP5*为60 kD,VP8*为28 kD,Western-blotting检测发现两目的蛋白所带标签可与抗体反应;③镍柱纯化获得RV SA11 VP5*、VP8*蛋白,纯度达90%。结论①构建表达载体pET-30a-VP5*、pET-30a-VP8*;②表达、纯化VP4蛋白的VP5*、VP8*片段。

轮状病毒vp8基因在原核系统中的初步表达

通过RT-PCR反应获得轮状病毒Wa株vp8基因的cDNA片段,将其克隆入pGEX-5X-1表达载体中,构建重组质粒pGEX-VP8,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆子并对插入片段vp8进行序列测定,诱导后通过SDS-PAGE检测重组蛋白,并观察表达量随时间变化的特征。结果显示,测序结果与vp8序列一致,VP8蛋白的表达量在诱导后6-8h达到高峰。

猪轮状病毒Gottfried株和SB-1A株截短VP8基因的原核表达、蛋白纯化及免疫原性分析

目的原核表达猪轮状病毒(porcine rotavirus,PRV)Gottfried株和SB-1A株截短的VP8*基因,纯化重组蛋白,并检测其免疫原性。方法经PCR从含有全长VP4基因片段的重组质粒pCR4-Gottfried VP4和pCR4-SB-1A VP4中分别扩增截短的VP8*基因(△VP8*,64～223位氨基酸),分别插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-Gottfried-△VP8*和pET-28a-SB-1A-△VP8*,分别转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。应用ProBondTMResin纯化两种重组蛋白,重组蛋白与A(lOH)3佐剂混合后,经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的血清抗体水平。结果两种重组表达质粒经双酶切和测序证实构建正确;表达的两种目的蛋白相对分子质量约25 000,均以包涵体和可溶性两种形式存在,均可与鼠源抗Histag单克隆抗体特异性结合;纯化的两种重组蛋白纯度均在95%以上,免疫BALB/c小鼠可产生较高的血清抗体水平。结论成功在大肠埃希菌中表达了PRV Gottfried株和SB-1A株截短的VP8*基因,纯化的两种蛋白免疫原性较好,为进一步研制安全、高效的PRV亚单位疫苗奠定了基础。

人A组轮状病毒结构蛋白VP8的卵黄抗体制备与活性检测

目的：制备人A组轮状病毒VP4结构蛋白N端的刺突蛋白VP8卵黄抗体IgY，并检测其生物学特征。方法以轮状病毒VP4基因的DNA为模板，采用PCR方法扩增VP8 DNA序列。将VP8片段克隆到原核表达载体 pET28a 上，形成重组质粒pET28a-VP8，转化基因工程菌E．coli BL21，完成VP8重组蛋白的诱导表达。 VP8包涵体蛋白经纯化和蛋白复性后，与弗氏佐剂混匀免疫产蛋鸡，收集鸡蛋，用水稀释-超滤法纯化卵黄抗体IgY。通过SDS-PAGE、Western blot、ELISA和点杂交等技术方法，分析该抗体的生物学特性，包括抗体的纯度、滴度、特异性和稳定性。结果 VP8在基因工程菌E．coli BL21中主要以包涵体蛋白形式表达，相对分子质量约为35×10^3，在pH8．0的Tris-HCI缓冲体系其复性效率可达90％。将重组抗原VP8免疫产蛋鸡，获得VP8抗原特异性的卵黄抗体IgY，抗体滴度达到1∶100000，且特异性地识别野生型A组轮状病毒。结论本研究采用基因工程和免疫技术制备的VP8卵黄抗体IgY，具有较高的抗体滴度和特异性，为婴幼儿轮状病毒感染性腹泻的诊断和防治提供了新的思路。

A组轮状病毒VP5~*和VP8~*的表达和免疫学性质研究(英文)

轮状病毒是引起婴幼儿腹泻的主要病原,VP4是RV重要的抗原蛋白,在早期病毒与细胞黏附过程中发挥重要作用,包括受体结合和细胞渗透。在细胞黏附过程中,VP4易被切割成VP5*和VP8*2个片段并以此增强病毒感染性。为了深入研究VP5*和VP8*的免疫学性质,进一步评价其应用前景,从TB-Chen株RV基因组中编码VP4蛋白基因上克隆了VP5*和VP8*开放读码框核苷酸序列,构建了表达质粒,在原核大肠杆菌系统中重组表达了VP5*和VP8*蛋白,进一步分析了它们的免疫学性质。结果显示,VP5*和VP8*可在E.coli中高效表达,重组蛋白VP5*(rVP5*)和VP8*(rVP8*)可诱导免疫豚鼠产生特异性血清抗体,这些抗体可特异性识别自身蛋白(rVP5*或rVP8*),可识别来自TB-Chen株的重组VP4蛋白,并可识别SA11和Wa感染的MA104细胞中合成的病毒VP4蛋白。这些结果表明,rVP5*和rVP8*蛋白具有较高的免疫原性,抗rVP5*和抗rVP8*的抗体具有高度特异性和交叉反应性。

牛UK株轮状病毒VP8蛋白多拷贝嵌合表位的免疫原性分析

轮状病毒VP8＊蛋白由纤突蛋白VP4裂解形成,VP8＊蛋白决定了VP4蛋白血清特异性中和反应相关,本试验原核表达UK株牛轮状病毒VP8＊多拷贝嵌合肽段,纯化并比较分析其免疫原性。首先根据GenBank上发表的牛轮状病毒UK株VP8＊蛋白的编码序列及可能的主要抗原表位区（aa 1~11和aa 218~235）,设计并合成引物,以扩增这两个区段的嵌合基因,克隆到原核表达载体pET-28α（＋）上,并通过酶切位点连接构建嵌合基因的3拷贝重复重组表达载体,同时构建单拷贝和全长VP8＊表达载体。重组载体转化到E.coli感受态细胞中,IPTG诱导表达后,重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot证实重组蛋白大小与预期相符且能与His-tag单抗发生特异性反应;ELISA结果表明免疫后3拷贝蛋白较单拷贝蛋白血清抗体水平更高。本试验确定了原核表达的3拷贝嵌合VP8＊重组蛋白免疫后具有良好的抗原性,为今后抗轮状病毒疫苗的研制及抗轮状病毒药物的发展提供参考。

P[14]型轮状病毒VP8蛋白特异结合A型组织血型抗原

目的 研究轮状病毒与组织血型抗原之间的关系。方法以直接从人粪便标本中检测到的比较少见的G8P[14]型轮状病毒为研究对象，表达纯化得到P[14]VP8蛋白，通过寡糖结合和唾液结合实验，研究其与组织血型抗原的结合。结果P[14]VP8蛋白可以与A型寡糖和A型唾液特异结合，而没有检测到与其他型别的组织血型抗原结合。结论A型组织血型抗原可能是P[14]型轮状病毒的潜在受体，这为进一步研究其他型别轮状病毒受体结合特征及轮状病毒监测提供了一定的基础和依据。

破伤风毒素T细胞表位P2对猪轮状病毒△VP8^＊蛋白免疫原性的增强作用

仔猪轮状病毒腹泻严重危害养猪业，为了开发亚单位疫苗，本课题组前期构建了猪轮状病毒SB-1A株截短的VP8^＊蛋白（△VP8^＊，64～223位氨基酸）原核表达载体pET28a—SB1A△VP8^＊。为了进一步提高亚单位疫苗的免疫原性，将破伤风毒素的通用T细胞表位P2引入重组亚单位蛋白，构建重组载体pET28a—P2-SB-IA△VP8^＊。P2-S13-1A△VP8^＊和S13-1A△VP8^＊在大肠杆菌中表达并纯化。重组蛋白与氢氧化铝佐剂混合后经肌肉注射免疫Balb／c小鼠，利用间接ELISA法检测免疫小鼠的血清抗体水平。结果显示：P2-S13-1A△VP8^＊和S昏1A△VP8^＊在大肠杆菌中得到了高水平、可溶性表达；重组蛋白P2-SB-1A△VP8^＊诱导的血清抗体水平显著高于SB-1A△VP8^＊，说明P2可以增强SB-1A△VP8^＊的免疫原性，为日后开发猪轮状病毒亚单位疫苗奠定了基础。

P[4]、P[6]和P[8]型轮状病毒VP8*核心区蛋白的表达和纯化

为进一步深入研究我国人群中轮状病毒主要流行的P[4]、P[6]和P[8]型毒株的受体结合特点及结构基础,本研究将P[4]、P[6]和P[8]型毒株VP8*核心区(VP8*core)基因分别构建到原核表达载体pGEX4T-1和pET30a中,利用大肠杆菌表达获得轮状病毒P[4]、P[6]和P[8]型毒株VP8*核心区蛋白,并通过亲和层析分别纯化得到VP8*core-GST融合蛋白和VP8*-his标签蛋白,SDS-PAGE显示蛋白大小分别为46kDa和20kDa。综上,本研究成功构建了pGEX4T-1-VP8*core和pET30a-VP8*core重组质粒,利用原核表达系统得到VP8*coreGST融合蛋白和VP8*core-his蛋白,为VP8*蛋白的功能和结构研究提供基础。

轮状病毒疫苗株VP8＊核心区蛋白的表达和纯化

目的为了研究轮状病毒疫苗株VP8t蛋白的功能和结构特征，利用原核表达系统纯化得到VP8}核心区蛋白（VP8＊core，64．223位氨基酸）。方法从口服疫苗中提取兰州疫苗株LLR病毒核酸，RT—PCR得到目的片段，克隆到pET30a载体中构建重组质粒。根据已合成的Rotateq和RotarixPf8]VP8$全长基因，PCR得到VP8{核心区片段，克隆到pET30a载体构建重组质粒。重组质粒转化大肠埃希菌BL21（DE3）进行蛋白表达。利用Histrap HP和superdex200纯化柱，通过亲和层析和分子筛层析纯化得到目的蛋白。结果VP8s核心区蛋白以可溶形式表达，并通过纯化得到较纯的VP8fcore蛋白，聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS—PAGE）显示相对分子质量约为20kDa。结论成功构建了pET30a—VP8＋core重组质粒，得到轮状病毒各疫苗株VP8score蛋白，为研究疫苗株受体结合特征以及疫苗评价提供了基础和参考。

重组轮状病毒疫苗VP8~*蛋白与组织血型抗原的结合性研究

目的评价轮状病毒(Rotaviruses,RVs)疫苗株Rotarix和RotaTeq VP8^*蛋白与组织血型抗原(histo-blood group antigens,HBGAs)基因融合的免疫效果。方法从GenBank获取Rotarix和RotaTeq两种疫苗VP8^*蛋白基因序列,根据大肠埃希菌常用密码子进行序列优化后人工合成Rotarix和RotaTeqVP8^*蛋白基因并采用PCR扩增合成的两种基因,引物上、下游分别引入Nde I和Xho I限制性内切酶酶切位点。将PCR产物及载体pET-30a用Nde I和Xho I双酶切,经1.5%琼脂糖凝胶电泳回收目的片段后在T4连接酶作用下连接,连接产物转化至DH5α感受态细胞并进行PCR鉴定,取阳性菌液提取质粒,经Nde I和Xho I双酶切鉴定正确后测序。将合成的基因序列与表达载体pET-30a连接后导入大肠埃希菌BL21(DE3),加入IPTG诱导表达,经Ni2+beads亲和层析纯化得到VP8*-His融合蛋白,进行SDS-PAGE电泳分析。利用寡糖结合试验检测目的蛋白与lea、lex、leb、ley、A、B、H1、H2 8种寡糖的结合特性,利用唾液结合试验检测VP8*蛋白与不同血型组织抗原表型唾液的结合特征。结果成功构建重组质粒,SDS-PAGE显示目的蛋白相对分子质量约为26×103,与预期的分子质量相符合。寡糖结合试验显示Rotarix和RotaTeq VP8^*蛋白能与H1型HBGAs结合,唾液结合试验显示二者能与分泌型唾液结合而不与非分泌型唾液结合。结论成功克隆表达了轮状病毒疫苗株Rotarix和RotaTeq VP8^*蛋白,两种蛋白均有与H1型HBGAs结合的特性。

轮状病毒Rotateq及Rotarix疫苗VP8~*蛋白的原核表达、纯化与鉴定

目的 :通过大肠埃希菌原核表达体系,分别获得轮状病毒疫苗Rotateq及Rotarix的VP8*基因表达产物,为深入研究轮状病毒VP8*蛋白的结构和功能奠定基础。方法 :基因合成轮状病毒疫苗Rotateq及Rotarix的P[8]型VP8*基因序列,将其克隆到携带有GST标签的pGEX-4T1表达载体中构建重组质粒pGEX-4T1-VP8*,测序正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),通过SDS-PAGE电泳检测表达产物,并通过Glutathione Sepharose 4B纯化柱进行纯化,Western Blot鉴定。结果 :SDS-PAGE电泳结果显示分子量52KD处有深染带,Western-Blot显示该处蛋白能与GST标签抗体结合。结论 :成功构建了包含Rotateq及Rotarix VP8*基因的重组表达载体pGEX-4T1-VP8*,获得了可溶性GST-VP8*重组蛋白。

猪源P[19]轮状病毒VP8＊蛋白的表达及受体结合特征

目的 研究猪源P[19]型轮状病毒（rotaviruses,RVs） VP8＊蛋白与寡糖的结合特征.方法 以中国轮状病毒监测中腹泻症状的猪粪便标本中检测到1株P[19]型RV为研究对象,表达纯化得到病毒VP8＊蛋白,通过寡糖结合,唾液结合实验方法对其与寡糖的结合特征进行研究.结果 猪源P[19] VP8＊蛋白与黏蛋白核心（mucin core）,尤其黏蛋白核心2具有很好的结合.结论 黏蛋白核心可能是猪源P[19] RV的潜在受体,为病毒感染机制的研究及其监测提供了一定的依据.

猪轮状病毒NJ2012株VP8基因序列分析及原核表达

为深入研究猪轮状病毒VP8蛋白的结构和功能,以及研制新型猪轮状病毒疫苗,利用生物信息学软件DNAStar对本研究室保存的1株A组G9P7型猪轮状病毒NJ2012的VP8基因序列进行核苷酸和氨基酸同源性分析;设计并合成1对引物,采用RT-PCR方法扩增VP8蛋白编码基因,用限制性核酸内切酶对目的片段与pET28a(+)原核表达载体进行双酶切,构建了重组原核表达载体,用IPTG诱导表达,并进行Western blot验证。结果显示:NJ2012毒株的VP8基因序列与参考毒株序列的核苷酸同源性为53.9%~99.2%,氨基酸同源性为42.1%~97.5%;VP8基因克隆成功,经测序与目的基因完全一致;经鉴定,构建的重组原核表达质粒pET28a-VP8能够在DE3宿主菌中表达,该蛋白以包涵体形式存在;Western blot结果显示该蛋白可与抗His-tag鼠单克隆抗体发生特异性反应。本研究实现了VP8蛋白在原核系统中稳定表达,为调查该蛋白的免疫原性及研制安全、高效的猪轮状病毒亚单位疫苗提供了参考。