VPI-7分子筛的合成及生物学性能

采用水热法,通过调变反应溶胶的量合成了不同尺寸的不规则圆片状多孔锌硅分子筛VPI-7,并研究了其生物学性能.扫描电子显微镜观测结果表明,制备的样本由VPI-7条状晶体聚集成微球,并进一步相互交联形成微米级孔隙,其形貌可以促进钙磷化合物在样品表面的沉积,同时可以负载并缓释蛋白.细胞学检测结果表明,VPI-7分子筛有利于细胞黏附增殖,具有良好的生物相容性.

O型口蹄疫病毒VP1基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

目的口蹄疫病毒的VP1蛋白是诱导中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达VP1基因,为建立O型口蹄疫抗体血清学诊断方法奠定基础。方法将O型口蹄疫病毒VP1基因插入pFastBacHIa载体,构建重组质粒pFast BacHIa-VP1。将该重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,VP1基因与Bacmid发生特异性位点转座。经PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到病毒基因组多角体蛋白基因启动子下游,提取阳性质粒转染Sf9昆虫细胞。结果SDS-PAGE电泳和Western blot检测结果表明VP1基因成功地在Sf9昆虫细胞中进行了表达,蛋白分子量为26.4kDa。结论VP1基因在Bac-to-Bac系统中的成功表达为口蹄疫病毒VP1蛋白的抗原性、免疫原性以及免疫抗体水平检测研究奠定了基础。

肠道病毒71型重组VP1蛋白的原核表达及初步鉴定

目的利用大肠杆菌原核表达系统表达并纯化肠道病毒71型(EV71)VP1蛋白,并对重组蛋白功能进行初步鉴定。方法 PCR扩增EV71VP1全长基因,在测序正确的基础上,将其插入表达载体pET28a(+),构建表达质粒pET28a(+)/VP1,转化表达菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,利用Ni 2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经ELISA和Western Blot,验证EV71VP1的抗原性。结果成功构建pET28a(+)/VP1重组质粒,经大肠杆菌表达、纯化获得分子量约为43kDa的融合蛋白,经ELISA和Western Blot,结果显示该蛋白有良好的抗原性。结论实现了肠道病毒7l型VP1蛋白的原核高效表达,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的研究奠定基础。

家蚕传染性软化病病毒(桐乡株)VP1基因片段的克隆及序列分析

以首株在中国分离到的家蚕传染性软化病病毒(Bombyx moriinfectious flacherie virus,BmIFV)BmIFV-CHN001基因组为模板,扩增了编码主要结构蛋白的VP1基因。克隆测序后得到VP1基因片段906bp。该序列与已发表的日本毒株相比,核苷酸序列的相似性为99.3%,编码氨基酸的相似性为100%,证明该毒株与家蚕传染性软化病病毒日本株的同源性较高。把BmIFV-CHN001的VP1序列与同属的另外6个昆虫小RNA病毒的结构蛋白进行序列比对,构建系统发育树,对其进化关系进行了初步分析,结果显示这7种病毒具有相近的亲缘关系,而BmIFV-CHN001与蜜蜂囊雏病毒的亲缘关系最近。

桃拉综合征病毒VP1高变区蛋白抗体制备及初步特性分析

目的:制备高效价的桃拉综合征病毒主要结构蛋白VP1高变区蛋白抗体,分析其免疫特性,为研究免疫诊断试剂做参考。方法:将p ET-VP1重组载体转化入大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下进行表达。重组VP1蛋白纯化后免疫新西兰家兔,用琼脂扩散试验及ELISA检测抗体效价,用与VP1纯化蛋白特异性结合的单克隆噬菌体做竞争抑制试验。结果:p ETVP1重组蛋白在大肠杆菌BL21中呈可溶性高效表达。抗血清经琼扩试验鉴定效价达1∶26,ELISA效价达1∶217。与VP1蛋白特异结合的单克隆噬菌体能阻断部分抗血清与VP1蛋白的结合活性,但不影响最终检测阳性的判断。结论:制备的VP1高变区蛋白抗体效价高,VP1蛋白少数区域的位点变异并不影响多克隆抗体的结合活性,可用作免疫检测诊断试剂。

禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白间接ELISA检测方法的建立

对AEV陕西分离株VP1基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting检测表达产物;以纯化的蛋白为包被抗原建立ELISA方法,并对反应条件进行优化。结果表明,VP1蛋白在大肠杆菌中成功表达,产物约为50 000的融合蛋白,具有良好的反应原性;优化的ELISA最佳工作条件为:重组抗原包被质量浓度3.8mg/L,37℃2h后4℃过夜,1%BSA 37℃封闭2h,待检血清1∶50稀释37℃孵育0.5h,酶标抗体1∶4 000稀释,37℃作用30min,底物37℃显色5min,临界值为0.360;建立的ELISA方法特异性强、重复性好、敏感性高;临床检测180份样品,与美国IDEXX公司AEV抗体检测试剂盒检测结果符合率为91.9%。该方法可用于临床样品的大批量检测。

肠道病毒71型衣壳蛋白VP1特异性识别和激活手足口病患儿CD4^+T细胞免疫活化

目的探讨肠道病毒病毒71型衣壳蛋白VP1诱导EV71感染患儿外周血T淋巴细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)应答特征。方法收集2010年9月至2011年12月西安交通大学医学院第二附属医院和西安市儿童医院住院的EV71感染手足口病患儿共31例,根据临床特征分为3组:急性感染期组(16例)、临床恢复期组(9例)和感染恢复后1个月组(6例);另外,选取10例健康儿童为对照组。通过重叠肽技术合成覆盖EV71衣壳蛋白VP1 36条重叠肽段作为抗原,采用IFN-γ酶联免疫斑点分析法(ELISPOT)和磁珠分选法(MACs)体外检测各组患儿EV71 VP1特异性CD4^+T细胞和CD8+T细胞免疫应答特征。结果急性感染期组有4例(25%)患儿对VP1蛋白存在T细胞免疫反应,临床恢复期组5例(56%)患儿对VP1蛋白存在T细胞免疫反应,其中EV71感染临床恢复期组患者反应强度最强,显著高于急性感染期,差异有统计学意义(Z=-2.042、P=0.041),而感染恢复后1个月组和对照组均未检测到T细胞免疫反应,临床恢复期组患者T细胞反应强度显著高于感染恢复后1个月组(Z=-2.105、P=0.035)和对照组(Z=-2.633、P=0.008),差异均有统计学意义;提示EV71感染患儿VP1蛋白被识别的频率(即例数)随着临床症状及体征消失而消失。VP1蛋白诱导的细胞免疫应答以特异性CD4^+T细胞为主导;筛选确定了8个EV71 VP1蛋白区CD4^+T细胞表位。结论 EV71感染患儿在发病期对VP1蛋白存在特异性T细胞反应,且以特异性CD4^+T细胞为主导;筛选确定EV71感染患儿VP1蛋白的CD4^+T细胞表位有助于阐明EV71感染的细胞免疫学发病机制。