P型PRSV-VPg蛋白与寄主eIF4E蛋白的互作

为研究番木瓜环斑病毒P型株系(PRSV-P)的病毒基因组连接蛋白(VPg)与寄主eIF4E蛋白的互作,采用双分子荧光互补技术(BiFc),通过基因枪转化法轰击洋葱表皮,在荧光显微镜下观察两者间的互作结果。结果表明:番木瓜eIF4E与P型PRSV-VPg,西瓜eIF4E与P型PRSV-VPg蛋白均发生互作。eIF4E与VPg的互作为研究通过转基因方法抑制或过量表达突变关键位点的寄主因子,阻断关键因子互作获得抗病植株提供了可行性依据。

小麦黄花叶病毒编码VPg蛋白N端结构是VPg与核仁蛋白Fibrillarin互作区域

小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)属于马铃薯Y病毒科大麦黄花叶病毒属成员,其基因组是由两条正义单链RNA组成,共编码10个蛋白。其中,VPg(Viral protein genome-linked)作为病毒末端结合蛋白,与病毒基因组RNA 5’端共价连接。利用软件分析WYMV VPg蛋白氨基酸序列发现其N端具有核定位信号(NLS)序列,C端具有核输出信号(NES)序列。通过激光共聚焦显微镜观察VPg与GFP融合蛋白在烟草细胞中的表达情况发现,GFP-VPg主要定位于细胞核中。利用eYFP(n)标记核仁结构蛋白Fibrillarin与VPg进行双分子荧光互补实验发现,VPg与Fibrillarin互作且定位于细胞核中。根据VPg结构特点构建一系列缺失突变体与Fibrillarin的互作实验验证了它们之间的互作区域发生在N端NLS区域。

PVX病毒载体介导2种马铃薯Y病毒科病毒VPg蛋白表达诱导烟草叶片系统坏死的研究

芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)和槟榔坏死环斑病毒(Areca plam necrotic ringspot virus,ANRSV)是马铃薯Y病毒科(Potyviridae)中分别可诱导十字花科作物和槟榔产生坏死病症的2种不同属病毒。VPg(Viral protein genome linked)作为与马铃薯Y病毒科病毒基因组5′端的结合蛋白,在病毒复制、翻译和运动等侵染过程中发挥重要作用。本研究利用In-Fusion克隆策略分别构建了可表达3′端融合Strep蛋白标签序列的ANRSV和TuMV VPg全长编码基因的马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)载体pPVX-VPg-AR和pPVX-VPg-Tu。通过农杆菌渗透注射接种本生烟(Nicotiana benthamiana),利用RT-PCR、Strep蛋白标签亲和层析和Western blot等方法证明了PVX病毒载体能够介导VPg-AR和VPg-Tu蛋白在本生烟中系统表达,且发现这2种VPg蛋白的过量表达诱导本生烟叶片产生了不同程度的系统性坏死病症。进一步采用DAB和NBT染色,在产生坏死症状叶片中检测到大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)的积累。因此,推测VPg可能是TuMV和ANRSV诱发植物病症产生的一个决定因子,为后续研究这2种病毒诱导症状形成机制奠定了基础。

马铃薯Y病毒基因组连接蛋白的原核表达及纯化

设计合成马铃薯Y病毒基因组连接蛋白基因的特异引物,以本实验室获得的AQ4分离物cDNA为模板,通过PCR方法扩增得到目的基因,连入表达载体PEHISEGFPTEV及PEHISTEV,用IPTG诱导,使其在大肠杆菌中得到正确表达,并利用镍柱对VPg蛋白进行纯化,为抗血清的制备以及VPg蛋白晶体结构和互作蛋白的研究奠定基础。

白菜翻译起始因子eIF(iso)4E.a/c与芜菁花叶病毒TuMV-C4/UK1蛋白互作分析

为阐明白菜翻译起始因子异构体eIF(iso)4E的表达特性,以及该异构体与芜菁花叶病毒(TuMV)的互作关系,在白菜‘极早春’中克隆了eIF(iso)4E.a基因,在‘BP8407’中克隆了eIF(iso)4E.c基因。这两个基因长度一致,均编码200个氨基酸。酵母双杂交和双分子荧光互补试验表明:eIF(iso)4E.a仅与TuMV-C4株系互作,而不与TuMV-UK1株系互作;eIF(iso)4E.c仅与TuMV-UK1株系互作,而不与TuMV-C4株系互作。对白菜eIF(iso)4E蛋白氨基酸序列及空间结构分析发现:eIF(iso)4E蛋白包含帽结合蛋白结构,eIF(iso)4E.a和eIF(iso)4E.c蛋白间存在20个差异氨基酸,其中17个差异氨基酸位于帽结合蛋白结构上;TuMV-C4 VPg与TuMV-UK1 VPg蛋白有4个氨基酸差异位点。通过对TuMV不同株系的VPg蛋白(病毒基因组连接蛋白)氨基酸序列频率分析发现,在4个氨基酸差异位点处,氨基酸的使用频率具有选择性。

对甘蔗线条花叶病毒存在抗性差异的2个甘蔗品种中eIF4E基因序列分析

甘蔗线条花叶病毒(sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)是近年引起甘蔗花叶病的主要病原,选育和利用抗病品种是防控甘蔗花叶病最经济有效的手段。不同品种对甘蔗花叶病具有不同抗性,明确抗性差异的来源对于选育抗病品种具有重要意义。本研究以SCSMV的高抗品种CP94-1100和高感品种ROC22为对象,对两个品种的致病病毒和真核生物翻译起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E,eIF4E)序列进行分析。在致病病毒方面,侵染CP94-1100和ROC22的SCSMV分离物cp基因和vpg基因核苷酸序列和蛋白编码情况基本相同,为同一分子变种。在寄主eIF4E方面,从CP94-1100和ROC22中均分离到eIF4E基因,均包含由663 bp构成的ORF,编码1个含220个氨基酸残基的多肽,氨基酸序列同源性仅为98.2%,说明抗性差异可能与eIF4E差异相关。生物信息学分析显示,CP94-1100和ROC22中eIF4E基因编码的蛋白均为稳定亲水性蛋白,属于IF4E家族蛋白,而CP94-1100中eIF4E基因编码的蛋白还包含1个CDC 33或PTZ00040的结构域。遗传分析表明eIF4E基因与禾本科其他作物高度相似,其中CP94-1100的eIF4E基因与割手密亲缘关系最近,说明它们也具有类似的功能。