鹅和番鸭细小病毒全基因克隆与序列分析

本研究采用PCR技术扩增了鹅和番鸭全长细小病毒基因;其中鹅和番鸭细小病毒非结构蛋白基因(NS)全长为1884bp,编码627个氨基酸;结构基因(VP)全长为2199bp,编码732个氨基酸;序列分析表明:鹅和番鸭细小病毒NS之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为80.9%～82.9%和89.5%～91.2%,而相应的鹅细小病毒之间的同源性为93.7%～99.8%和96.8%～99.7%,番鸭细小病毒之间的同源性为98.8%～99.8%和98.6%～99.5%;在核苷酸和氨基酸水平上,鹅和番鸭细小病毒VP1之间的同源性分别为79.7%～88.7%和85.5%～93.3%,而相应的鹅细小病毒之间的同源性为88.8%～99.6%和91.5%～99.2%,番鸭细小病毒之间的同源性为98.1%～99.6%和97.1%～98.8%;番鸭和鹅细小病毒NS和vp1基因的系统进化树分析表明:番鸭和鹅呼细小病毒来自共同的祖先,但随着宿主的不同而演化为不同的分支。

鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定与VP1基因序列分析

为确定发病鸭场的致病原,掌握该致病原的遗传进化特征,研究从山东省某鸭场采集到1份短喙与矮小综合征(SBDS)疑似病例病料,采用永生化鹅胚上皮细胞系(GEEC)对病料进行病毒分离培养,观察细胞病变,测定分离毒株的血凝性、病毒滴度(TCID_(50))、对鸭胚的致病性,并进行VP1基因序列比对及相似性分析。结果显示:临床病料分离培养的病毒可引起GEEC出现细胞明显皱缩、聚集、折光性增强等典型细胞病变,表明分离到一株鸭源NGPV毒株,命名为SDHZ株,该病毒对1%鸡红细胞无凝集性,TCID_(50)高达10^(-6.25)/mL,鸭胚半数致死量(ELD_(50))为10^(-4.5)/mL,接种鸭胚死亡出现全身及肝脏出血、短喙、发育迟缓等典型症状,VP1基因序列与樱桃谷鸭中分离的新型鹅细小病毒(NGPV)相似性为95.3%~98.0%,与GPV经典毒株的相似性为89.3%~94.6%。表明该鸭场本次疫病病原为NGPV,为进一步研究NGPV致病机制及制定综合防控措施提供参考。

鸡传染性贫血病毒vp1基因的克隆表达及抗原性分析

从组织病料中提取CAV核酸,根据GenBank上发表的序列设计两对引物,分别扩增出vp1的139 bp～83 bp和547 bp～1337 bp两个基因片段,然后分别将其充隆到原核表达载体PMXB10上,经PCR和酶切鉴定,证明成功构建了重组表达载体PMXB10-vp1C和PMXB10-vp1D。在0.3 mM的IPTG诱导下,融合蛋白在大肠杆菌ER_(2566)以分泌型得到大量表达,经大量表达后,用几丁质柱挂柱切割纯化后,得到切割蛋白E、F,在Western blot免疫分析印迹中,两组融合蛋白和切割蛋白与CAV阳性血清均能发生特异性反应。用ELISA方法检验,纯化的两组蛋白与CAV阳性血清均能发生特异性反应。用两组蛋白免疫SPF鸡后,用全病毒ELISA试剂盒检测血清呈阳性,表明两组蛋白均可诱发机体产生抗CAV的抗体。

鸡贫血病毒(CAV)vp1基因的克隆及与其他CAV vp1基因的比较(英文)

把一个新鸡贫血病毒(CAV)的vp1基因通过PCR扩增,然后克隆到质粒载体pUC18上.vp1基因包含1 347个碱基对,并且推定的VP1蛋白氨基酸序列含有449个氨基酸.通过DNA BLAST软件把该基因的序列数据与在(Gen-Bank中发表的其他vp1基因比较显示,克隆的vp1基因与已发表的其他vp1基因之间存在许多核甘酸差异.核甘酸的变异导致其编码蛋白质的某些氨基酸发生改变.氨基酸的改变主要集中在VP1蛋白的29、75、125、141、144、251、254、447位.在这些变异中,许多氨基酸的电荷和/或疏水性发生了改变,例如:Gly→Glu、Val→G1u、Ala→Thr、Leu→GIn、Cys→Trp、Leu→Arg、Arg→Ala、Gly→Ser、Ser→Ala、Glu→GIy、Gly→Thr等.通过CLUSTAL X软件比较了6个不同的vp1基因.该vp1基因已被(GenBank登录(登录编号:AF448446).VP1蛋白是CAV的唯一衣壳蛋白,因此VP1的氨基酸变异可能影响该蛋白质的抗原特征.对该vp1基因进一步进行免疫学研究具有重要意义,并且有可能应用该基因构建CAV基因工程疫苗.

2020—2021年咸阳市手足口病病原构成及柯萨奇病毒A6型序列分析

目的了解咸阳市手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)病原谱构成情况,分析柯萨奇病毒A6型(coxsackievirus A6,CVA6)VP1基因序列特征。方法对2020—2021年收集的HFMD病例样本进行反转录实时荧光定量聚合酶链式反应(reverse transcription real time PCR,RT-qPCR)检测分型,分析病原学监测结果;选取部分CVA6阳性样本,采用半巢式RT-PCR法扩增病毒VP1片段全长,扩增产物经测序后进行序列相似性和基因进化分析。结果2020—2021年共收集咸阳所辖县(区)HFMD样本615例,经RT-qPCR检测肠道病毒(enterovirus,EV)阳性率为72.20%(444/615)。其中CVA6样本占阳性样本总数的61.94%(275/444),其次是其他EV型22.07%(98/444)、CVA16型13.51%(60/444)、CVA10型2.48%(11/444)。2020年CVA6为主要流行毒株,2021年其他EV、CVA6与CVA16共同流行。EV阳性病例的发病时间在2021年呈双峰分布(5—7月为主高峰和9—11月为次高峰),2020年发病高峰为9—11月。秦都区、旬邑县和三原县EV阳性样本最多,总占比超过50%。与2008年芬兰株(KM114057)相比,本研究中的35条VP1序列核苷酸相似性为92.0%~94.4%,氨基酸序列相似性97.4%~98.7%,存在7个主要突变位点,其中A5T、S27N、V30A、S137N突变率接近100.00%。VP1基因进化分析显示,咸阳市2020—2021年CVA6型均属于D3a分支。结论2020—2021年咸阳市HFMD病原谱变化显著,CVA6为优势毒株,属于D3a基因亚型,需加强CVA6及其他EV分子病原学监测。

新乡地区2011年肠道病毒71型VP1基因特征分析及手足口病流行特点

为了解新乡地区2011年肠道病毒71型(EV71)VP1基因特征及手足口病流行特点,采用荧光RT-PCR对临床诊断的粪便标本进行总肠道病毒(EV)、柯萨奇病毒A16(CA16)和EV71检测;选取10例EV71阳性标本进行VPl序列扩增并测序,所得序列进行同源性分析和构建系统发生树;对2011年新乡市手足口病疫情监测数据进行分析。结果显示,重症标本的EV71阳性率(73%)显著高于CA16阳性率(19%)(P<0.01);10株新乡EV71分离株的核苷酸及氨基酸差异分别为2.8%和0.9%,属于C4亚型的C4a簇;9株VP1区第170位氨基酸为A,1株为V;与近缘的C4a型代表株相比,新乡优势株的氨基酸变异一般发生在VP1第292位氨基酸(T→A);2011年新乡市共上报手足口临床诊断病例1118例,92%的发病年龄在3岁以下,发病高峰分别出现在4和12月份,提示一定要加强手足口病预防控制,寒冷天气尤其不能忽视。