溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统vscC基因缺失株的构建

[目的]构建未引入任何遗传标记物的溶藻弧菌vscC基因框内缺失突变株。[方法]首先以溶藻弧菌ZJ51-O基因组DNA为模板,用重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)扩增法构建体外vscC基因缺失片段;扩增产物经酶切后连接至自杀质粒pDM4,再转化入大肠杆菌SY327进行克隆,筛选阳性克隆子并进行PCR分析鉴定;提取阳性克隆子的自杀重组质粒pDM4-△vscC,用热休克法将其转入到大肠杆菌S17-1中,再经接合生殖的方式将自杀重组质粒导入溶藻弧菌ZJ51-O菌株中,利用抗生素筛选策略与蔗糖反向筛选系统,挑选疑似目的突变菌株,最后利用PCR鉴定与测序分析进行确证。[结果]溶藻弧菌ZJ51-O的vscC基因框内缺失突变株构建成功。[结论]该研究为进一步研究vscC基因的功能和T3SS在溶藻弧菌致病过程中所起的作用奠定基础,同时也为溶藻弧菌的其他基因突变株的构建和研究提供了参考和试验经验。

溶藻弧菌III型分泌系统vscC基因缺失株的构建(英文)

[目的]构建未引入任何遗传标记物的溶藻弧菌vscC基因框内缺失突变株。[方法]首先以溶藻弧菌ZJ51-O基因组DNA为模板,用重叠延伸PCR(gene splicing by overlapext ension PCR,SOE-PCR)扩增法构建体外vscC基因缺失片段;扩增产物经酶切后连接至自杀质粒pDM4,再转化入大肠杆菌SY327进行克隆,筛选阳性克隆子并进行PCR分析鉴定;提取阳性克隆子的自杀重组质粒pDM4-△vscC,用热休克法将其转入到大肠杆菌S17-1中,再经接合生殖的方式将自杀重组质粒导入溶藻弧菌ZJ51-O菌株中,利用抗生素筛选策略与蔗糖反向筛选系统,挑选疑似目的突变菌株,最后利用PCR鉴定与测序分析进行确证。[结果]溶藻弧菌ZJ51-O的vscC基因框内缺失突变株构建成功。[结论]该研究为进一步研究vscC基因的功能和T3SS在溶藻弧菌致病过程中所起的作用奠定基础,同时也为溶藻弧菌的其他基因突变株的构建和研究提供了参考和试验经验。

外阴鳞癌动物模型的建立及MDM2表达的研究

目的:探讨外阴鳞癌动物模型建立的方法,研究在鼠外阴癌变发生、演进过程中MDM2的表达变化。方法:采用苯甲酸雌二醇注入32只129/J型鼠腹部皮下,8只为对照组,观测肿瘤的体积,取材做病理诊断。采用RT-PCR技术检测MDM2基因的mRNA表达。结果:外阴上皮内瘤变(VIN)发生率为65.5%(19/29),其中VIN1、VIN2各5例,VIN39例;外阴鳞状细胞癌(VSCC)发生率为34.5%。VIN1～2、VIN3、VSCC和对照组中,MDM2基因的mRNA的相对表达量分别为0.34±0.11、0.42±0.20、1.84±0.32和0.30±0.01;VSCC分别与VIN1～2、VIN3和对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:129/J型鼠可为外阴病变(VINs/VSCC)的研究提供动物模型。MDM2在鼠外阴鳞癌中的变化与人组织相同,MDM2可作为外阴癌变的生物学指标。

p63、p73在外阴鳞癌中的表达及临床意义

目的探讨p63、p73蛋白在外阴鳞状上皮细胞癌发生发展中的作用。方法应用免疫组化技术检测p63、p73蛋白在20例正常外阴组织,30例外阴上皮内肿瘤组织以及44例外阴鳞状上皮细胞癌组织中的表达水平。结果 p63和p73蛋白在正常外阴组织,外阴上皮内肿瘤组织及外阴鳞癌组织中均可表达。在正常外阴组织,外阴上皮内肿瘤组织及外阴鳞癌组织中p63和p73阳性表达率呈递增趋势。p63表达与手术病理分期和腹股沟淋巴结转移情况有关,p73表达与腹股沟淋巴结转移情况有关。p63和p73蛋白在外阴鳞癌中的表达呈正相关(γs=0.438,P=0.03)。结论在外阴鳞癌中,p63和p73蛋白表达均明显增强,两者异常表达与外阴鳞癌恶性生物学行为密切相关。p63和p73共同参与外阴鳞癌发生进展。

外阴鳞癌皮损中HIF-1α蛋白的检测

目的探讨HIF—1α与外阴鳞癌的关系。方法用免疫组化SABC法检测HIF-1α在30例外阴鳞癌10例外阴正常皮肤中的表达情况。结果外阴鳞癌中Ⅰ-Ⅱ期HIF-1α阳性细胞数与Ⅲ-Ⅳ期相比差异有统计学意义(P<0.05);高分化与中分化和低分化相比差异有统计学意义(P<0.05)。无淋巴结转移与有淋巴结转移的相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论HIF-1α的表达与外阴鳞癌的恶性进展有关,临床分期晚,分化程度差,有淋巴结转移的外阴鳞癌HIF-1α表达增高。

外阴鳞状细胞癌肿瘤干细胞的分选和鉴定

目的:分离外阴鳞状细胞癌A-431细胞系中CD44^+的细胞亚群,鉴定其具有肿瘤干细胞特性。方法:采用流式细胞术分选出CD44免疫荧光抗体标记的CD44^+细胞亚群,检测CD133、CD34蛋白在CD44^+和CD44^-中表达的差异,检测CD44^+及CD44^-细胞亚群的细胞周期。结果:A-431细胞系中CD44^+细胞亚群约占4%,胚胎干细胞因子CD133、CD34在CD44^+和CD44^-的VSCC中表达存在显著性差异,主要在细胞膜上表达,CD44^+的肿瘤细胞亚群97.69%处于G_1期,CD44^-的肿瘤细胞亚群61.12%处于S期。结论:在A-431细胞系中CD44可以作为分选肿瘤干细胞的特异性表面标志物,CD133、CD34在CD44^+的肿瘤细胞高表达,可能成为分选外阴鳞癌肿瘤干细胞的特异性表面标志物,CD44^+肿瘤细胞具有典型的干细胞增殖特点。

S100A7和S100A4在外阴鳞癌与外阴硬化性苔藓中的表达及意义

目的:检测外阴鳞癌(vulvar squamous cell carcinoma,VSCC)及外阴硬化性苔藓(vulvar lichen sclerosus,VLS)中S100A7和S100A4蛋白的表达,探讨其与疾病的发生发展关系。方法:采用免疫组化方法测定S100A7及S100A4蛋白在25例VSCC、20例VLS及15例外阴正常皮肤组织中的表达,并结合临床病理资料进行分析。结果:S100A7蛋白在VLS和VSCC中的表达明显高于正常皮肤(P<0.05),且早期VLS中的表达高于进展期(P<0.05);Ⅲ期VSCC中的表达高于Ⅰ-Ⅱ期(P<0.05),高分化VSCC中的表达高于中低分化(P<0.05)。S100A4蛋白在VLS中的表达与正常皮肤无明显差异(P>0.05),但早期VLS中的表达高于进展期(P<0.05);S100A4在VSCC的癌巢中几乎不表达,但在间质细胞中的表达高于正常皮肤(P<0.05),中低分化VSCC中的表达高于高分化(P<0.05)。S100A4表达与临床分期无关。结论:S100A7和S100A4蛋白高表达与VSCC的发生、发展有关,与VLS的进展呈负相关。