肾透明细胞癌VSIG4表达及其与免疫细胞浸润的相关性研究

目的:探究VSIG4在肾透明细胞癌(ccRCC)中的表达及其与免疫细胞浸润和预后的关系。方法:从癌症基因组图谱(TCGA)数据库中下载ccRCC的RNA-seq数据和患者相应的临床数据;通过Wilcoxon秩和检验分析ccRCC及正常肾组织中VSIG4 mRNA表达水平;Wilcoxon秩和或Kruskal-Wallis秩和检验分析VSIG4表达与临床病理参数的相关性;Kaplan-Meier法分析VSIG4表达与患者预后的相关性;基因集富集分析(GSEA)探究VSIG4在ccRCC中参与的信号通路;使用R软件运行CIBERSORT算法分析VSIG4表达与肿瘤浸润免疫细胞的相关性;Western blotting检测人正常肾上皮细胞系293T和人肾癌细胞系ACHN、A-498、786-O、OS-RC-2中VSIG4蛋白表达。结果:VSIG4在ccRCC中的表达水平显著高于正常组织(P<0.05);VSIG4的表达与患者远处转移分期和淋巴结转移分期显著相关(P<0.05);生存分析显示,VSIG4高表达组患者总体生存率显著低于低表达组患者(P<0.05);GSEA富集分析结果显示,VSIG4主要在凋亡、趋化因子信号通路、细胞黏附分子等信号通路富集;VSIG4表达与M1巨噬细胞呈负相关(r<0,P<0.05),而与M2巨噬细胞呈正相关(r>0,P<0.05);免疫印迹结果表明,肾癌细胞中VSIG4蛋白表达均高于人正常肾上皮细胞系。结论:VSIG4在ccRCC中高表达,且与预后呈负相关,可能成为ccRCC患者预后的生物标志物。

视网膜色素变性中VSIG4基因变异对小胶质细胞功能的影响及其作用机制

目的研究视网膜色素变性(RP)中的V-set和免疫球蛋白结构域4(VSIG 4)基因变异对小胶质细胞功能的影响及其作用机制。方法利用免疫荧光染色检测VSIG4在小鼠视网膜中的定位。给HMC3细胞(人小胶质细胞系)转染野生型(Len-WT)、突变型(Len-Mut)VSIG 4基因以及转染空载病毒(Len-Cont),并通过有或无脂多糖(LPS)刺激HMC3细胞分为对照组、LPS-Len-WT组、LPS-Len-Mut组、LPS-Len-Cont组、Len-WT组、Len-Mut组和Len-Cont组。采用实时荧光定量PCR检测炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA表达水平;采用Western blot法检测核因子红细胞系2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、核转录因子κB(NF-κB)p65亚单位(P65)和磷酸化P65(PP65)的蛋白表达水平;采用吞噬实验检测细胞吞噬功能;采用细胞划痕和Transwell实验检测细胞迁移能力。将LPS刺激状态下的HMC3细胞与661W细胞(小鼠视网膜感光细胞)共培养,采用Western blot法检测B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达水平,采用凋亡实验检测661W细胞的凋亡数量。结果VSIG4定位于小鼠视网膜小胶质细胞。实时荧光定量PCR检测结果显示,与LPS-Len-WT组相比,LPS-Len-Mut组HMC3细胞IL-1β、TNF-αmRNA相对表达量均显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。Western blot检测结果显示,与LPS-Len-WT组相比,LPS-Len-Mut组HMC3细胞Nrf2、HO-1、GPX4的蛋白表达水平均显著降低,PP65/P65比值显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。吞噬实验检测结果显示,Len-Cont组、LPS-Len-Cont组、LPS-Len-WT组和LPS-Len-Mut组细胞吞噬率分别为(35.67±3.22)%、(63.67±10.07)%、(84.00±3.46)%和(64.67±2.31)%,各组HMC3细胞吞噬率总体比较差异有统计学意义(F=59.06,P<0.001)。与LPS-Len-WT组相比,LPS-Len-Mut组HMC3细胞吞噬率显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞划痕和Transwell实验检测结果显示,与LPS-Len-WT组相比,LPS-Len-Mut组HMC3细胞24、48 h时迁移率和24 h时单位面积侵袭细胞数显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与LPS-Len-WT组相比,共培养系统中LPS-Len-Mut组Bax/Bcl-2蛋白表达量比值及细胞凋亡数量显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论VSIG4定位于小鼠视网膜小胶质细胞。RP中的VSIG 4基因变异后,LPS刺激状态下的HMC3细胞NF-κB信号通路激活,Nrf2/HO-1信号通路活化程度减弱,细胞分泌炎症因子增多;吞噬和迁移能力减弱;共培养系统中细胞凋亡增加。

巨噬细胞特异表达共刺激分子VSIG4对实验性肾间质纤维化的影响

目的:探讨巨噬细胞特异表达共刺激分子VSIG4与实验性小鼠肾间质纤维化的关系。方法:SPF级雄性C57B6(VSIG4-/-及VSIG4+/+)小鼠共40只,其中VSIG4-/-肾小管间质性肾炎模型组(n=20)和VSIG4+/+肾小管间质性肾炎模型组(n=20),两个模型组下分别设术前7d及单侧输尿管梗阻后3d、7d、14d4个时相点,每个时相点各5只。模型组行左输尿管结扎。采用自动生化分析仪检测小鼠血肌酐、尿素氮水平。于术前7d、术后第3、7、14天观察肾小管损害及肾间质炎性细胞浸润程度,免疫组化技术观察病变肾组织TGF-β1和MMP-2的表达。结果:①血肌酐及尿素氮水平在两个模型组间无统计学意义。②与VSIG4+/+肾小管间质性肾炎模型组相比,VSIG4-/-肾小管间质性肾炎模型组肾间质炎性细胞浸润和肾小管损害程度明显加重(P<0.05),肾组织TGF-β1表达明显升高(P<0.05),MMP-2表达显著降低(P<0.01)。结论:VSIG4-/-的小鼠肾间质炎性细胞浸润、肾小管损害加重,病变肾组织TGF-β1的表达上升和MMP-2的表达下调。提示VSIG4在抑制肾小管间质损伤的病理进程中发挥作用。

人VSIG4基因转染细胞的构建及其对T细胞的共刺激效应的初步研究

目的:分别构建含有人VSIG4基因两种不同变异体(VSIG4L和VSIG4S)的重组逆转录病毒载体,获得稳定表达VSIG4L和VSIG4S基因的L929细胞并初步研究其对T细胞的共刺激作用及可能机制。方法:从人肺cDNA文库中扩增出VSIG4L和VSIG4S的全长基因,并分别克隆入T载体中,再双酶切装入逆转录病毒载体pEGZ-Term中,与辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T,以其培养上清感染L929细胞72小时后,经Zeocin筛选出稳定表达VSIG4L或VSIG4S分子的L929细胞株;采用RT-PCR和流式细胞仪分析VSIG4分子的表达,MTT和ELISA分别检测T细胞增殖及IL-2的分泌。结果:构建了含人VSIG4L基因和VSIG4S基因的重组逆转录病毒载体,并获得含有VSIG4L基因和VSIG4S基因的重组病毒,筛选获得能稳定高表达人VSIG4L和VSIG4S分子的L929转基因细胞;该转基因细胞具有体外抑制T细胞增殖、活化和IL-2分泌的作用。结论:构建了稳定表达人VSIG4L和VSIG4S膜型分子的细胞株,该分子两种不同变异体在体外均可抑制T细胞增殖和IL-2分泌。

靶向巨噬细胞膜蛋白Vsig4特异性纳米抗体的构建和筛选

目的构建V-set and immunoglobulin domain containing 4(Vsig4)特异性纳米抗体,以期作为巨噬细胞的分子探针。方法用Vsig4重组蛋白对羊驼进行免疫,分离血液中的淋巴细胞,利用噬菌体展示技术,构建噬菌体展示文库,经过连续3次生物淘筛获得与Vsig4蛋白结合的噬菌体,经测序和基因比对所得VHH序列,用ELISA法筛选出抗Vsig4的高亲和力纳米抗体,并用Vsig4稳定表达细胞系验证纳米抗体的结合能力。结果成功构建了插入率为70%、库容量为7.27×107的噬菌体表达文库,经过克隆筛选获得136个Vsig4阳性单克隆,经测序获得15个不同的VHH基因,将这些基因克隆至原核表达体系,表达和纯化后获得了高纯度的Vsig4纳米抗体,其中Nb119的亲和力最高,并且可以与Vsig4稳定表达细胞系结合。结论成功构建并筛选了特异性、高亲和力的Vsig4纳米抗体,以期用于检测巨噬细胞表面Vsig4的表达和构建特异性分子探针。

基于VSIG4的腺病毒对1型糖尿病的治疗

目的探讨基于含V-set和免疫球蛋白城4(VSIG4)的腺病毒对1型糖尿病(T1DM)的治疗效果。方法制备含有VSIG4的腺病毒,免疫NOD小鼠,观察对CD8+T细胞的抑制效应和血糖水平的调节作用。结果与携带β-半乳糖苷酶(LacZ)基因的重组腺病毒(Ad-LacZ)和PBS组比较,携VSIG4的腺病毒并能抑制NOD小鼠的CD8+T细胞增殖和细胞因子干扰素(IFN)-γ的分泌,并降低NOD小鼠糖尿病的患病率。结论VSIG4腺病毒对CD8+T细胞具有免疫抑制效应,并可以延缓NOD小鼠糖尿病的发生,可能会为T1DM的治疗新策略。

乳腺癌组织中VSIG4、雄激素受体的表达及其与临床病理特征和腋窝淋巴结转移的关系

目的 探究乳腺癌组织中VSIG4、雄激素受体的表达及其与临床病理特征和腋窝淋巴结转移的关系。方法 选取乳腺癌患者75例,收集患者临床资料。采用免疫组化法检测乳腺癌组织中雄激素受体(AR)的表达水平、RT-PCR法检测VSIG4水平,并分析其与临床病理特征和腋窝淋巴结转移的关系。结果 AR的表达与乳腺癌的淋巴结转移有关(P<0.05),VSIG4的表达与乳腺癌的淋巴结转移、病理分期、组织学分级有关(P<0.05)。AR、VSIG4的表达与腋窝淋巴结转移数目有关(P<0.05),AR阳性患者腋窝淋巴结转移数目显著高于AR阴性,VSIG4水平越高腋窝淋巴结转移数目越多。AR、VSIG4是乳腺癌患者腋窝淋巴结转移水平的影响因素(P<0.05)。结论 乳腺癌组织中VSIG4、雄激素受体与临床病理特征有关,是影响腋窝淋巴结转移的独立因素,具有重要临床意义。

两株鼠抗人VSIG4单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究

目的:制备鼠抗人VSIG4分子单克隆抗体(mAb)及对其生物学特性进行鉴定。方法:以高表达膜型VSIG4分子的基因转染细胞L929/VSIG4L为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术,经流式细胞术检测和多次克隆化培养,筛选出特异分泌鼠抗人VSIG4分子的杂交瘤细胞株;采用间接免疫荧光法、Westernblot、竞争抑制试验及MTT增殖试验等对单抗的生物学特性进行鉴定。结果:获得2株持续、稳定分泌鼠抗人VSIG4mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为9A7和9D5。对mAb生物学特性的研究结果表明,2株mAb均能识别巨噬细胞以及Jurkat、THP-1、H446等肿瘤细胞株表面的VSIG4分子。对T细胞增殖抑制的阻断实验显示,这2株抗体对VSIG4分子抑制T细胞增殖均有阻断作用。结论:成功地获得了2株鼠抗人VSIG4功能性mAb,为进一步研究VSIG4及其未知受体的生物学功能奠定了基础。

B7家族共刺激分子VSIG4在巨噬细胞/T细胞共培养模型中的作用

目的探讨巨噬细胞表达共刺激因子VSIG4(V-set and immunoglobulin domain-containing protein 4)对T细胞增殖与活化的影响。方法分别从VSIG4基因敲除型(VSIG4-/-)小鼠和同窝的野生型(VSIG4+/+)小鼠(遗传背景为C57BL/6)腹腔收集巨噬细胞,在CD3单抗的刺激下与T细胞共培养,设为VSIG4-/-/T组及VSIG4+/+/T组,经CD3单抗刺激的T细胞单独培养设为对照组,未经CD3单抗刺激的T细胞单独培养设为空白组。3H-TdR掺入法检测细胞增殖;FACS测T细胞的活化标志CD69;酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测共培养上清中IL-2、IFN-γ蛋白表达变化,RT-PCR法检测IL-2、IFN-γ基因水平表达变化。结果两共培养组中T细胞3 H掺入量均低于对照组(P<0.01);CD69阳性率、IL-2、IFN-γ的蛋白及基因表达同样均低于对照组(P<0.05);且VSIG4+/+/T组中T细胞以上指标相对于VSIG4-/-/T组下降更加明显,且两组间比较差异显著(P<0.05)。结论巨噬细胞特异表达的共刺激因子VSIG4在巨噬细胞与T细胞共培养抑制T细胞增殖活化的过程中发挥了作用。

牛Ⅱ型胶原蛋白诱导VSIG4^(-/-)鼠的关节炎模型

目的以Ⅱ型胶原蛋白诱导的VSIG4-/-(C57BL-6背景)小鼠关节炎模型为研究对象,探讨VSIG4在RA疾病进程中的作用。方法取SPF级DBA/1、VSIG4-/-(C57BL-6背景)以及Ncf1-/-(C57BL-6背景)小鼠,以牛Ⅱ型胶原蛋白(CⅡ)与完全佛氏佐剂完全乳化,尾根部皮下注射,在第21天以牛Ⅱ型胶原蛋白与不完全弗氏佐剂加强免疫获得CIA模型。定期观察小鼠关节改变,并进行关节评分。用H&E染色法观察小鼠关节组织病理学改变并采用流式细胞术检测脾淋巴细胞以及腹腔巨噬细胞中TNF-α的变化。结果与Ncf1-/-及DBA/1小鼠相似,VSIG4-/-小鼠在牛Ⅱ型胶原蛋白免疫后开始出现明显的多关节肿胀,即小鼠踝关节病理检测显示明显的滑膜增生,炎症细胞浸润以及关节坏死。进一步研究发现来源于VSIG4-/-关节炎模型小鼠与同系正常小鼠相比,虽然脾淋CD4+T巴细胞分泌的TNF-α没有显著性差异(P>0.05),但是腹腔巨噬细胞分泌的TNF-α具有显著性差异(P<0.05)。结论牛Ⅱ型胶原蛋白可诱导VSIG4-/-小鼠的关节炎,而腹腔巨噬细胞分泌的TNF-α在其发病过程中可能起关键作用。

新型免疫调节分子VSIG4介导免疫清除及炎症的研究进展

VSIG4(V-set and Ig domain-containing 4)是新近鉴定的特异性表达于组织静息巨噬细胞表面的B7家族相关蛋白,又称补体受体Ig超家族分子(complement receptor of the Ig superfamily,CRIg)或Ig超家族蛋白-39(Ig superfamily protein 39,Z39Ig)。功能研究显示,VSIG4一方面可通过结合细胞表面的受体分子有效地抑制T细胞的活化,另一方面其也可作为补体受体并清除补体C3包被的病原体或自身抗原。最新研究提示,VSIG4还可选择性的抑制补体旁路途径的活化。本文将对VSIG4的蛋白质结构、表达方式和功能做一综述。

VSIG4在乳腺癌中的表达及其与免疫浸润和预后的相关性

目的分析M2型巨噬细胞在乳腺癌组织中的浸润丰度,探索VSIG4与M2型巨噬细胞的相关性及调控乳腺癌侵袭和迁移的潜在机制。方法下载TCGA-BRCA的RNA-seq数据,CIBERSORT评估样本的免疫细胞浸润丰度,构建预后风险预测模型。分析M2型巨噬细胞及VSIG4对乳腺癌患者预后的影响,基因集富集分析VSIG4参与的信号通路,并预测其上游调控miRNA。结果M2型巨噬细胞的浸润丰度与年龄、PR状态、病理分期共同参与构建风险预测模型,模型预测性能较好(AUC=0.816)。M2型巨噬细胞的高浸润(HR=1.35,P<0.05)及VSIG4的高表达(HR=1.4,P=0.039)提示乳腺癌患者预后较差。VSIG4受上游miR-29a-3p调控,与Toll样受体、细胞黏附、细胞因子的生成及释放等通路显著相关。结论VSIG4与乳腺癌患者预后及M2型巨噬细胞浸润丰度显著相关,受上游miR-29a-3p调控,VSIG4促进乳腺癌细胞的侵袭和迁移,可作为乳腺癌的潜在预后标志物。

免疫调节分子VSIG4在炎症性疾病中的作用机制研究进展

免疫调节分子VSIG4是一种特异性表达于巨噬细胞的B7家族相关蛋白的Ⅰ型跨膜蛋白,既具有抑制T细胞增殖与活化的能力,又能作为补体受体清除补体C3包被的病原体或自身抗原。近年研究显示,作为致癌基因的VSIG4不仅在癌症中发挥作用,在多种炎症性疾病如实验性自身免疫性脑脊髓炎、炎症性肠炎、肝炎以及关节炎等多种疾病也起着至关重要的作用。为了更加系统地了解VSIG4在炎症性疾病中的作用以及作用机制,本文总结归纳VSIG4在炎症性疾病中所涉及的分子机制或通路,以期为VSIG4治疗炎症性疾病的方法和手段提供科学依据,并进一步为VSIG4在炎症性疾病中的临床应用提供理论支撑。

过表达VSIG4对小鼠体内日本血吸虫生殖系统发育的影响

目的观察过表达VSIG4(仅表达于组织驻留型巨噬细胞的免疫球蛋白超家族补体受体)的小鼠体内日本血吸虫生殖系统的发育情况,探讨宿主VSIG4基因表达水平对日本血吸虫雌雄虫生殖系统发育及虫卵产生的影响。方法将20只小鼠随机分为对照组和过表达VSIG4组,分别尾静脉注射空载腺相关病毒和过表达VSIG4的腺相关病毒,1周后将两组小鼠感染日本血吸虫尾蚴。感染6周后收集两组小鼠体内的日本血吸虫成虫,并采用明矾洋红染色法对虫体生殖系统进行染色,在光学显微镜和激光共聚焦显微镜下观察日本血吸虫生殖器官的变化,包括雌虫的卵巢大小、卵母细胞及子宫内虫卵的数量,雄虫的睾丸数量与大小、精母细胞。结果与对照组相比,过表达VSIG4组小鼠体内的虫体数量显著下降[分别为(18.8±11.3)条、(13.2±2.27)条],且过表达VSIG4组小鼠中每克肝脏虫卵沉积数量显著降低[分别为(26448±7736)个、(45618±3764)个](均P<0.05)。过表达VSIG4组雌虫子宫内虫卵数量明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01),子宫内虫卵排列也较为稀疏,卵巢内多为界限模糊的未成熟卵母细胞。与对照组相比,过表达VSIG4组小鼠体内的日本血吸虫雄虫的睾丸面积减少(P<0.05),精囊缩小,精子数量减少。结论证实VSIG4的表达可能抑制日本血吸虫雌雄虫的生殖系统发育,从而显著影响雌虫子宫内虫卵数量,减少了肝脏沉积虫卵数量。

人VSIG4-Fc融合蛋白的表达及其生物学活性的研究

为获取人VSIG4-Fc融合蛋白,并研究其对T细胞的调节效应。首先采用PCR获取人VSIG4基因的胞外段序列及人IgG1Fc恒定区序列,将两者顺次连接插入逆转录病毒载体,以293T为包装细胞,制备含病毒颗粒的培养上清,反复感染CHO细胞,Zeocin筛选能稳定分泌VSIG4-Fc蛋白的基因转染细胞并以RT-PCR、Dot-blot及Western blot等鉴定。以MTT和ELISA分别检测VSIG4-Fc融合蛋白对T细胞增殖及IL-2分泌的影响。结果成功获取了CHO基因转染细胞,该细胞能稳定分泌VSIG4-Fc蛋白,纯化后的VSIG4-Fc蛋白能与T细胞表面未知受体结合,并具有体外抑制T细胞增殖、活化和IL-2分泌的作用。

Vsig4和免疫球蛋白Fc段融合蛋白的真核表达纯化

目的:本项目将通过构建中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)真核表达系统获取小鼠Vsig4膜外端和免疫球蛋白Ig G3a-Fc段的融合蛋白,鉴定Vsig4-Fc和Vsig4纳米抗体的相互作用。方法:采用重合延伸PCR法融合小鼠Ig G3a-Fc和Vsig4胞外段的基因序列,将该融合基因插入真核表达载体中并转染CHO细胞。Western blotting鉴定转染细胞上清中的目标蛋白,通过连续两次亚克隆筛选,获得高表达小鼠Vsig4-Fc融合蛋白的单克隆,之后大量培养增殖转染细胞并收集细胞培养上清,选择Protein A柱纯化方法纯化Vsig4-Fc蛋白,最后经ELISA法鉴定Vsig4-Fc和纳米抗体的结合能力。结果:在CHO细胞中成功构建了小鼠Vsig4-Fc真核表达稳转系,并且在真核表达体系中获得可表达15 mg/L的双分子结构Vsig4-Fc的稳定转染细胞系。经鉴定小鼠Vsig4-Fc融合蛋白能与Vsig4纳米抗体结合。结论:重合延伸PCR法使得Vsig4和Fc基因片段的融合更为高效,两次亚克隆筛选优势细胞系大幅提高了真核蛋白的表达量,为进一步研究Vsig4的生物学功能奠定重要基础。

基于公共数据库分析VSIG4在结直肠癌中的表达及意义

目的 研究VSIG4在结直肠癌(CRC)中的表达及其对患者预后的影响,并探索VSIG4表达在CRC中与免疫细胞浸润的关系。方法 本研究对来源于多个公共数据库中的VSIG4 mRNA表达数据进行汇总分析。GO、KEGG和GSEA富集分析用于进一步探索VSIG4在CRC中的生物学作用和参与的信号通路。通过CIBERSORT算法分析VSIG4与免疫细胞浸润的关系,进一步探讨VSIG4的表达对CRC患者预后的影响。结果 基于3 524例样本的汇总分析证实VSIG4在CRC中表达下调(SMD=-0.60)。SROC曲线分析提示VSIG4可较好地区分CRC样本和非癌对照组样本(AUC=0.75)。GO、KEGG和GSEA富集分析提示VSIG4主要通过调节信号受体的结合与活性从而调节肿瘤免疫反应。CIBERSORT分析表明VSIG4高/低表达两组CRC样本间免疫细胞浸润有显著性差异。基于970例CRC患者总生存期数据的汇总分析提示VSIG4的表达情况与CRC患者预后显著相关。结论 本研究证实VSIG4在CRC中表达下调,并通过调节免疫反应参与CRC的发展过程,从而影响患者预后。

补体受体及共抑制分子VSIG4的研究进展

巨噬细胞表达的共刺激分子VSIG4(V set and Ig domain-containing 4)是一种B7家族相关蛋白,可作为T细胞活化的第二信号,调节T细胞的功能状态。同时,VSIG4也可作为补体受体,发挥识别病原体、调节补体旁路途径及抑制炎症反应的作用,在维持免疫耐受方面发挥着重要作用。本文回顾总结了VSIG4的表达及其在机体免疫中的作用。

VSIG4在恶性肿瘤诊治中的研究进展

VSIG4(the protein V-set and immune globulin domain-containing 4)是一种与巨噬细胞蛋白质相关的新的B7相关免疫球蛋白的Ⅰ型跨膜蛋白,具有抑制T细胞活化的能力,也被称为CRIg(免疫球蛋白超家族)和Z39Ig,在病原体识别和清除中起关键作用。恶性肿瘤中,VSIG4的表达及VSIG4阳性T细胞的增加可能预示更高的侵袭性和复发风险。全文就VSIG4与各肿瘤间的关系作一简要概述,为VSIG4与恶性肿瘤诊治提供参考。

人原代单核细胞经地塞米松刺激后的吞噬功能及转录组变化研究

背景噬血淋巴组织细胞增多症(hemophagocytic lymphohistiocytosis,HLH)是由于多种原因导致的过度的全身性炎症反应和器官功能障碍,高剂量的地塞米松常用于抑制炎症,血清可溶性VSIG4(sVSIG4)可作为评估巨噬细胞活化的标志物用于诊断HLH。目的探究地塞米松刺激人原代单核细胞高表达VSIG4后的吞噬功能及基因转录表达变化,并筛选关键表达基因和通路。方法体外分离人外周血单个核细胞,使用磁珠分选法阳选出CD14^(+)单核细胞,加入地塞米松刺激,使用qPCR、流式细胞术和Western blot分别在mRNA和蛋白水平上检测VSIG4的表达,并用Western blot检测细胞培养上清中sVSIG4的表达,在地塞米松刺激VSIG4表达的同时检测单核细胞吞噬功能;利用RNA-seq对地塞米松刺激前后的人原代单核细胞差异基因进行测序,并进行KEGG通路富集和蛋白质互作分析,通过节点分析找到hub基因和关键信号通路。结果体外地塞米松刺激单核细胞在mRNA和蛋白水平促进VSIG4表达上调(P<0.01),具有剂量依赖性和时间依赖性;地塞米松刺激的单核细胞过表达VSIG4会发生胞外段剪切生成sVSIG4;地塞米松刺激的VSIG4^(+)单核细胞吞噬作用增强(P<0.01)。RNA-seq差异分析中,共有491个差异表达基因,其中上调159个,下调332个;KEGG通路富集显示差异基因主要集中在EB病毒感染、新冠病毒感染、补体和凝血级联反应、NOD样受体信号通路、嘧啶代谢、C型凝集素受体信号通路、吞噬小体、金黄色葡萄球菌感染、Ⅰ型糖尿病、RIG-Ⅰ样受体信号通路、Toll样受体信号通路等信号通路(P<0.05);从PPI网络确定了20个hub基因。结论体外地塞米松刺激人原代单核细胞可以促进VSIG4表达上调,同时生成sVSIG4,VSIG4^(+)单核细胞可能具有更强的吞噬功能。转录组分析提示部分炎症相关基因和信号通路可能与VSIG4的表达调控和噬血淋巴组织细胞增多症的发病机制有关。