生理力学载荷维持衰老VSMCs合成表型

目的动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)引起的心脑血管疾病是一类典型的与衰老密切相关的增龄性疾病。衰老血管在多个层面发生退行性改变,血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)是血管中膜的力学响应细胞,在衰老进程中发生表型转换,进而导致细胞间通讯及功能发生变化。这些改变可影响AS的进展,但其在生理力学环境下的表型和功能改变尚不清楚。本研究旨在探讨周期性生理牵张刺激下衰老VSMCs的表型转换,初步了解力学载荷通过调控衰老VSMCs进而参与AS进展。方法原代VSMCs经过氧化氢诱导衰老,在确认合适浓度后q PCR结合免疫印迹筛选合适的表型标志物。进一步将原代VSMCs接种于Flexcell培养板,生长至融合状态后诱导衰老,Flexcell-4000T牵张系统10%幅度、1Hz加载12 h后收取细胞,免疫印迹检测标志物并半定量其表达水平。结果30μM的过氧化氢诱导原代VSMCs成衰老状态;定量筛选出衰老VSMCs高表达合成型标志物Col VIII、ZO-2,与免疫印迹结果一致;生理力学加载后衰老VSMCs维持上述合成型标志物高表达,并低表达收缩型标志物SMMHC、SM22α。结论生理环境下衰老VSMCs维持了力学响应能力,并通过表型和功能改变促进AS进展。

虎杖苷对VSMC内钙信号的调节机制初探

目的 观察虎杖苷对大鼠主动脉平滑肌细胞(VSMC)内游离钙浓度的变化 ,以探讨虎杖苷对血管平滑肌细胞的调节机制。方法 用荧光染料Fluo 3 AM标记细胞 ,在粘附式细胞仪上测定细胞内游离钙的变化。结果 给予虎杖苷 5min后 ,VSMC内游离钙浓度升高。当虎杖苷加入前 10min用河豚毒素和优降糖分别预处理后 ,其VSMC内游离钙都不再明显升高 ;而给予普萘洛尔、甲氰咪胍及亚甲蓝分别预处理时 ,细胞内钙浓度反而升得更高 ,与单纯虎杖苷作用相比差异都有显著性。结论 虎杖苷可增加细胞内游离钙浓度 ,其作用可能与钠、钾通道开放有关 ,并且受 β肾上腺素能受体、H2 受体系统及鸟苷酸环化酶系统的反向调节。

补肾活血通络法对动脉粥样硬化易损斑块内VSMCS凋亡与RANTES水平相关性研究

目的:(1)观察补肾活血通络法对动脉粥样硬化易损斑块的稳定作用及其稳定斑块的可能机制;(2)探讨血清和斑块局部受激活调节正常T细胞表达和分泌因子(Regulated on Activated Normal T cell Expressed and Secreted factor,RANTES)水平与血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)凋亡程度的相关性。方法:将健康雄性新西兰兔34只,随机分成空白对照组(K组)和造模组(B组)。空白对照组8只,给予普通饲料喂养18周。造模组(B组)26只,给予高脂饲料喂养,实验开始第1周一次性注射牛血清白蛋白,实验第10周,随机抽取2只兔做病理检测证实模型组已形成粥样斑块。其余B组兔随机分为模型对照组、辛伐他汀组、健脑软脉方组。辛伐他汀组、健脑软脉方组分别予以辛伐他汀、健脑软脉方水煎剂干预,模型对照组予以生理盐水灌胃,持续8周,实验结束,于处死动物前24 h和48 h 2次给予药物触发易损斑块(中国斑点蝰蛇毒和组胺)。空白对照组(K组)按上述给药时间和部位给予同等剂量无菌生理盐水注射。实验终点处死实验兔,开胸迅速分离主动脉全长,检测各项指标。结果:模型对照组的主动脉病变程度、血脂水平、血清RANTES水平、斑块内RANTES m RAN和蛋白表达水平、VSMCs凋亡率与健脑软脉方组、辛伐他汀组、空白对照组相比有显著差异(P<0.05),健脑软脉方组和辛伐他汀组与空白对照组相比有显著差异(P<0.05),健脑软脉方组和辛伐他汀组之间无显著差异(P>0.05)。结论:本研究表明补肾活血通络法可能通过调节血脂水平,抑制炎症反应,抑制平滑肌细胞凋亡,从而抑制模型兔动脉粥样硬化斑块的不稳定性进展。

I型内皮素受体反义寡聚核苷酸抑制VSMC增殖及内膜增生

目的 观察 型内皮素受体 (ETA)反义寡核苷酸(ODN)对血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖和内膜增生的抑制作用 .方法 1细胞培养 :取家兔主动脉中膜消化后培养传代 ,经抗 α- actin鉴定后使用第 4～ 6代传代细胞 ;2人工合成ODN:经 Genbank检索筛选 ,合成含 18bp ETA- ODN片段 ,再对 5 端硫代修饰以增加稳定性 ,同时行地高辛标记以检测反义片段的细胞膜穿透性 ;3 MTT分光光度法检测 ETA-ODN对 VSMC增殖的抑制作用 ;4运用放射受体结合分析法 (1 2 5I- ET- 1)了解 ODN对 ETA蛋白表达的抑制作用 ,以探讨其反义作用 ;5兔颈动脉空气干燥模型在体研究 ODN对血管内膜增生的抑制作用 :应用 F- 12 7凝胶载体携带 ETA-ODN(3.0μmol· L- 1 )导入血管周围 ,术后不同时间观察增生内膜相对厚度 .结果 ODN于培养后 12 h进入细胞内 ,并逐渐增加 ;15 μmol· L- 1 ETA- ODN对 VSMC增殖具有抑制作用 ,2 4h后即有显著作用 ;ETA- ODN对 ETA表达亦有明显的抑制作用 ,表现为 CPM于 2 4h逐渐减少 ;ETA- ODN导入后 ,血管增生内膜相对厚度减少 .结论 ETA- ODN以浓度和时间依赖方式抑制 ETA蛋白表达以及 VSMC的增殖 ;反义寡核苷酸是通过反义机制实现对 ETA蛋白和

普伐他汀对激活的VSMC增殖和细胞因子合成的干预作用

目的研究不同浓度普伐他汀对体外培养的经脂多糖 (LPS)激活的狗血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖和细胞因子合成的影响。方法 10、10 0、5 0 0 μmol/L普伐他汀 ,于作用后 2 4h和 4 8h采用MTT比色法观察VSMC增殖情况 ,ELISA法观察细胞因子IL 6和TNF α的表达。结果作用 2 4h后 ,10 0、5 0 0 μmol/L的普伐他汀可抑制VSMC的增殖 ,而各浓度均可抑制IL 6的合成 (P <0 .0 5 ) ;作用 4 8h后 ,各浓度普伐他汀均可抑制VSMC增殖和IL 6合成 ,10 0、5 0 0 μmol/L组作用大于 10 μmol/L组 (P<0 .0 5 ) ;普伐他汀对TNF α合成无显著影响 (P >0 .0 5 )。结论一定浓度的普伐他汀可抑制VSMC增殖和细胞因子IL 6的合成 ,该作用可能与时间和剂量有关。

“调肝肾、祛痰瘀”治法早期干预对自发性高血压大鼠子鼠血压及VSMC钙离子浓度的影响

目的 :观察早期应用中药复方干预对高血压发生的抑制及预防作用。方法 :应用“调肝肾、祛痰瘀”治法制备中药复方 ,作用于 SHR胚胎形成期和 (或 )高血压发病前期 ,观察其对 SHR高血压发生的时相、升高幅度以及主动脉平滑肌细胞 [Ca2 +] i浓度的影响。结果 :在高血压发病前期经应用中药复方干预后 ,可延缓子鼠高血压发生的时相及降低其血压升高幅度 ;此外 ,孕期及出生后均应用中药复方干预 ,可使主动脉平滑肌细胞 (VSMC) [Ca2 +] i浓度下降到正常大鼠水平。结论 :证明“调肝肾、祛痰瘀”方药早期干预高血血发病前期 ,可降低主动脉平滑肌细胞 [Ca2 +] i浓度而延缓高血压的发生。

AT2R基因可调控表达在血管紧张素Ⅱ介导的体外培养VSMC增殖中作用

目的 研究血管紧张素Ⅱ 2型受体 (AT2R)基因可调控表达对体外培养血管平滑肌细胞(VSMC)表达细胞周期蛋白依赖性激酶 2 (CDK2 )、增殖细胞核抗原 (PCNA)以及 p2 1的影响 ,旨在探讨AT2R基因在VSMC上条件表达在再狭窄防治中的潜在意义。方法 本研究通过常规分子生物学方法 ,建立四环素类似物Doxycycline可调控表达AT2 R基因的双重稳定VSMC细胞系。应用RT PCR和免疫细胞化学染色技术 ,观察该双重稳定表达AT2R的VSMC细胞系中CDK2、PCNA及 p2 1的mRNA及蛋白表达情况 ;采用血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )及其Ⅰ型、Ⅱ型其受体拮抗剂干预上述细胞 ,观测上述指标的变化。 结果 ①加入Doxycycline前转染组低水平表达CDK2、PCNA ;AngⅡ 10 - 7mol/L干预VSMC后CDK2、PCNA表达显著增加 (P <0 .0 1) ;在AngⅡ 10 - 7mol/L干预的同时加入Doxycycline后 ,CDK2、PCNA的表达受到显著抑制 (P <0 .0 1) ,但仍高于基础水平 (P <0 .0 1) ;ATIR拮抗剂CV 11974可进一步下调CDK2、PCNA的表达 ;AT2R拮抗剂PD12 3319干预组CDK2、PCNA强表达 (与AngⅡ组比较 ,P >0 .0 5 )。②加入Doxycy cline前转染组 p2 1表达处于高水平 ;AngⅡ 10 - 7mol/L干预VSMC后 p2 1表达显著降低 (P <0 .0 1) ;在AngⅡ 10 - 7mol/L干预的同时加入Doxycycline后 。

Ang Ⅱ和Cx43通过VSMCs参与血管钙化的研究进展

血管钙化（vascular calcification）主要由过量的钙盐在细胞介导下主动沉积于血管组织所致。钙化血管的舒张功能下降,血管僵硬度增加,并且血管里面的血小板粘附和聚集性都增强,易引起动脉血栓的形成和动脉粥样硬化斑块的破裂,因此,可以认为血管钙化是导致心血管疾病的重要危险因子。

AT2R基因可调控表达对体外培养VSMC基质金属蛋白酶2表达的影响

目的 研究血管紧张素Ⅱ 2型受体 (AT2R)基因可调控表达对体外培养血管平滑肌细胞(VSMC)基质金属蛋白酶 2形成的影响 ,旨在探讨AT2R基因在VSMC上条件表达在再狭窄防治中的潜在意义。方法 本研究通过常规分子生物学方法 ,建立四环素类似物Doxycycline可调控表达AT2 R基因的双重稳定VSMC细胞系。应用RT PCR和免疫细胞化学染色技术 ,观察该双重稳定表达AT2R的VSMC细胞系中基质金属蛋白酶 2的mRNA及蛋白表达情况 ;采用血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )及其Ⅰ型、Ⅱ型其受体拮抗剂干预上述细胞 ,观测上述指标的变化。结果 Doxycycline干预前 ,AT2R的表达处于静止状态 ,通过Doxycycline(1μg/ml)的干预 ,可以使该VSMC系稳定表达AT2R。加入Doxycycline前转染组低水平基质金属蛋白酶 2 ;AngⅡ 10 - 7mol/L干预VSMC后基质金属蛋白酶 2的mRNA及蛋白表达均显著增加 (P <0 .0 1) ;在AngⅡ干预的同时加入Doxycycline后 ,基质金属蛋白酶 2的mRNA及蛋白表达受到显著抑制 (P<0 .0 1) ;ATIR拮抗剂CV 11974可进一步下调上述mRNA及蛋白的表达 ;AT2R拮抗剂PD12 3319干预组基质金属蛋白酶 2mRNA及蛋白仍旧强表达 (与AngⅡ组比较 ,P >0 .0 5 )。 结论 AngⅡ干预VSMC后通过ATIR介导引起基质金属蛋白酶 2表达增强 ;

全反式维甲酸对VSMC、EGF-R基因表达和[Ca^(2+)]_i的影响

应用细胞培养、斑点杂交和荧光探针技术,观察到全反式维甲酸明显抑制胎牛血清诱导的血管平滑肌细胞表皮生长因子受体 mRNA 表达和[Ca^(2+)]_i 增加。

一氧化氮诱导VSMC凋亡观察

目的研究动脉粥样硬化和冠脉气囊成形术后再狭窄中血管平滑肌细胞数量异常增多的机制，并初步探讨ＮＯ诱导血管平滑肌细胞凋亡的作用。材料和方法 以ＳＮＡＰ作为ＮＯ供体，采用ＨＥ，ＴＵＮＥＬ，荧光双染后光镜观察以及电镜、流式细胞术、细胞ＤＮＡ的琼脂糖凝胶电泳对ＳＮＡＰ作用下的细胞凋亡进行鉴定和检测。结果 观察发现， ０．４ｍｍｏｌ／Ｌ ＳＮＡＰ作用 ８－１０ ｈ即能明显地诱导培养的血管平滑肌细胞凋亡。结论 ＳＮＡＰ以浓度依赖方式诱导血管平滑肌细胞凋亡；细胞爬片的ＨＥ染色结合ＴＵＮＥＬ标记是检测凋亡的较为准确且简单的方法。

黄酮类化合物作用mTOR抑制VSMCs增殖的研究进展

VSMCs的异常增殖是血管增殖性疾病的病理基础。mTOR具有调控细胞存活、增殖和凋亡等重要功能。RAP与mTOR结合,抑制下游底物磷酸化,阻止细胞周期进程,抑制增殖。黄酮类化合物结构与RAP相似,可作用于mTOR及其结合蛋白,抑制VSMCs增殖。

24-乙酰泽泻醇A对ox-LDL诱导大鼠VSMC表型转化的影响及其与ERK1/2通路的关系

目的观察24-乙酰泽泻醇A(alisol A 24-acetate)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化及其表型转化过程中合成基质金属蛋白酶9(MMP-9)能力的影响,并探讨与ERK1/2的相关性。方法以酶消化法体外培养大鼠VSMC,ox-LDL(50 mg/L)进行诱导,24-乙酰泽泻醇A(10 mg/L)进行干预,免疫细胞化学染色观察VSMC收缩表型标记蛋白SM22α的变化;RT-PCR检测VSMC MMP-9 mRNA的表达及Western blot检测VSMC MMP-9和ERK、p-ERK蛋白表达的变化。结果在ox-LDL诱导下,VSMC收缩表型标志蛋白SM22α的表达降低,细胞向合成型转化,促进MMP-9的合成,伴随着ERK1/2磷酸化水平升高(P<0.05);在24-乙酰泽泻醇A的干预下,VSMC收缩表型标志蛋白SM22α的表达增加,细胞向收缩表型转化,伴随着MMP-9及pERK的表达下降(P<0.05)。结论 24-乙酰泽泻醇A能有效抑制VSMC表型转化和MMP-9的表达,其机制可能与抑制ERK1/2信号通路有关。

川芎嗪对AngⅡ诱导的VSMCs增殖中CaM和CaN活性的影响

目的探讨不同浓度川芎嗪在不同作用时间内对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的VSMCs(VSMCs)增殖的抑制作用。方法建立AngⅡ诱导VSMCs增殖模型,用酶促反应定磷法观察不同浓度的川芎嗪在不同时段内对VSMCs中钙调蛋白(CaM)和钙调神经磷酸酶(CaN)活性影响。结果成功建立AngⅡ诱导的VSMCs增殖模型,川芎嗪各组CaM和CaN活性随川芎嗪的浓度和作用时间的延长而显著下降(P<0.01)。结论川芎嗪对AngⅡ诱导的VSMCs增殖的抑制作用有剂量和时间依赖性,其抑制机制可能与其干预CaN依赖的信号转导途径有关。

粉防己碱对糖尿病大鼠VSMCs增殖的抑制作用

目的:探讨粉防己碱对糖尿病大鼠血管平滑肌细胞(vascularsmooth musclecells,VSMCs)增殖及核转录因子-κB(NF-κB)的影响。方法:采用组织块贴壁法培养糖尿病及正常大鼠VSMCs,通过细胞计数试剂盒(cellcounting kit-8,CCK-8)测定粉防己碱对糖尿病及正常VSMCs的抑制作用,以免疫荧光-共聚焦显微镜检测粉防己碱对糖尿病VSMCs中NF-κB核转运影响。结果:粉防己碱能抑制糖尿病及正常VSMCs的增殖,其IC_(50)分别为(11.35±1.24)、(28.01±4.35)μmol/L;不同浓度的粉防己碱干预糖尿病VSMCs 24 h后显著抑制NF-κB的激活,减少核转运。结论:粉防己碱对糖尿病VSMCs增殖的抑制作用强于正常VSMCs,其机制与减少糖尿病VSMCs中NF-κB的核转运有关。

Rho激酶调节缺氧处理VSMC收缩反应性与MLC20磷酸化的关系

目的观察Rho激酶调节缺氧处理的VSMC收缩反应性与MLC20磷酸化的关系。方法取肠系膜动脉VSMC,观察缺氧不同时间VSMC收缩反应性变化及Rho激酶活性调节剂对VSMC收缩反应性的影响。同时观察Rho激酶的激动剂和抑制剂对缺氧VSMCMLC20磷酸化水平以及MLCP和MLCK活性的影响。结果缺氧后,VSMC收缩反应性发生明显变化,缺氧10min时VSMC收缩反应性有所升高,缺氧60、90以及120min后,VSMC收缩反应性明显降低。Rho激酶激动剂Ang-Ⅱ(10-9mol/L)可升高缺氧90minVSMC收缩反应性,Y-27632拮抗Ang-Ⅱ的作用增强。缺氧后VSMCMLC20磷酸化水平明显降低,MLCP活性明显升高,MLCK活性明显降低,Rho激酶激动剂Ang-Ⅱ(10-9mol/L)可使缺氧引起的降低的MLC20磷酸化水平升高,使增高的MLCP活性降低,Y-27632(10-5mol/L)可拮抗Ang-Ⅱ的这一作用。Ang-Ⅱ和Y-27632对缺氧后VSMCMLCK活性无明显影响。结论MLC20磷酸化在Rho激酶调节缺氧VSMC收缩反应性变化中具有重要作用,Rho激酶可通过调节MLCP的活性来调节休克MLC20磷酸化水平,MLCK在Rho激酶调节休克MLC20磷酸化中无明显作用。

主动脉夹层中层P53、MDM2及TRIM25的表达变化和VSMC表型转化

目的探讨主动脉中层中α-SMA、OPN、P53、MDM2和TRIM25蛋白在主动脉夹层中的表达变化及其意义。方法将12例A型AD手术患者的升主动脉作为实验组,12例DCD供体的升主动脉作为对照组。用免疫组化和Western blot法检测α-SMA、OPN、P53、MDM2、TRIM25和p-P53在AD组及对照组中的表达情况,用RT-PCR技术检测AD组及对照组组织中P53、MDM2及TRIM-25mRNA含量。结果通过Western blot法和RT-PCR法检测结果显示,P53、MDM2和TRIM-25的蛋白、mRNA含量在AD组织中明显增加,免疫组化检测也表明P53、MDM2和TRIM25含量增加,但其p-P53水平却下降。免疫组化结果显示α-SMA阳性细胞在AD组中的含量较对照组显著减少,而OPN阳性细胞在AD组增高,进一步Western blot法检测也证实了这一变化。结论 AD主动脉中层中VSMC表型向去分化型转变,而P53、MDM2、TRIM25的表达量增高,提示TRIM25可能通过影响P53/MDM2反馈环而导致VSMC表型转变参与AD形成。

AVP对VSMC脂质过氧化的影响及CGRP、SP的调节作用

研究ＡＶＰ对ＶＳＭＣ脂质过氧化的影响及ＣＧＲＰ，ＳＰ的调节作用。方法；以培养的大鼠血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）为模型，动态观察了精氨酸加压素（ＡＶＰ）为ＶＳＭＣ脂质过氧化的影响，及降钙素基因相关肽（ＣＧＲＰ），Ｐ物质（ＳＰ）对ＡＶＰ作用的调节，旨在探讨它们在高血压病发病中的意义。结果：（１）１０＾－７Ｍ的ＡＶＰ作用后，ＶＳＭＰ的丙二醛（ＭＤＡ），含量明显高于对照组（Ｐ〈０．０１）；

AT_2受体cDNA重组质粒转染入培养的大鼠VSMC

目的 :将构建的AT2 RcDNA重组质粒转染到培养的大鼠血管平滑肌细胞 ,为研究AT2 R对血管平滑肌细胞生长的影响提供实验基础。方法 :扩增、纯化重组质粒后 ,用脂质体介导法将重组质粒转染入培养的大鼠血管平滑肌细胞 ,分别用AT2 RmRNA原位杂交、AT2 R抗体免疫组化的方法从RNA和蛋白水平检测转染效果。结果 :原位杂交显示部分细胞浆棕黄色阳性反应 ,显示转染率为 9% ,免疫组化结果显示部分血管平滑肌细胞膜上有AT2 R蛋白存在。结论 :成功将AT2 RcDNA重组质粒转染到培养的大鼠血管平滑肌细胞中。转染后AT2 R能在大鼠主动脉平滑肌细胞表达的现象为进一步研究AT2 R对成年大鼠血管平滑肌细胞生长。