VX765对大鼠骨关节炎和软骨细胞炎症的作用

目的研究VX765对大鼠骨关节炎(osteoarthritis,OA)和软骨细胞炎症的影响及其作用机制。方法分离4周龄SD大鼠膝关节软骨细胞,取第3代细胞采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测不同浓度(0、1、5、10、20、50、100μmol/L)VX765对大鼠软骨细胞活性的影响;体外构建脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导细胞炎症模型,将细胞分为对照组、LPS组、无明显细胞毒性VX765浓度1组和VX765浓度2组,行Western blot、实时荧光定量PCR和ELISA检测炎症因子TGF-β1、IL-6和TNF-α表达水平,Western blot和免疫荧光染色检测核因子E2相关的转录因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)和血红素氧化酶1(heme oxygenase 1,HO-1)表达。将32只SD大鼠随机分为假手术组(A组)、OA组(B组)、OA+VX765(50 mg/kg)组(C组)和OA+VX765(100 mg/kg)组(D组),每组8只。A组仅行膝关节前内侧切口,B~D组在A组基础上横切内侧副韧带和前交叉韧带,并切除内侧半月板;术后1周,C、D组分别灌胃给药50 mg/kg和100 mg/kg VX765,A、B组给予等量生理盐水灌胃。通过HE及番红固绿染色行组织病理学检查,并通过Mankin评分进行评估;采用免疫组织化学染色技术分析基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP-13)和Ⅱ型胶原蛋白的表达。结果CCK-8法检测示VX765浓度高于10μmol/L后细胞活力显著降低(P<0.05),选择无明显细胞毒性的4μmol/L和8μmol/L VX765进行后续实验。LPS诱导后细胞中的TGF-β1、IL-6和TNF-α表达显著高于对照组(P<0.05),而在4μmol/L和8μmol/L VX765干预后表达较LPS组显著下降(P<0.05)。Western blot和免疫荧光染色检测示VX765显著上调Nrf2通路相关分子Nrf2和HO-1的蛋白表达(P<0.05),激活Nrf2通路。大鼠膝关节组织病理学检查和免疫组织化学染色示,与B组相比,C、D组VX765处理改善了大鼠OA中关节结构损伤,减轻了炎症反应,下调MMP-13表达,增加Ⅱ型胶原蛋白的表达。结论VX765可改善大鼠OA并减轻软骨细胞的炎症反应,其潜在机制可能是通过激活Nrf2通路。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1抑制剂VX765对冷束缚诱导小鼠急性胃溃疡的作用

目的观察半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1抑制剂VX765对冷束缚诱导小鼠急性胃溃疡胃黏膜的保护效应。方法将24只无特殊病原体级雄性C57BL/6J小鼠按照随机数字表法分为正常对照组、冷束缚组、VX765预处理＋冷束缚组、雷贝拉唑预处理＋冷束缚组，每组6只。正常对照组小鼠仅在腹腔内注射10 mL/kg二甲基亚砜（DMSO）和PBS混合液。冷束缚组小鼠在腹腔内注射DMSO和PBS混合液，30 min后行冷束缚实验诱导急性胃溃疡。VX765预处理＋冷束缚组、雷贝拉唑预处理＋冷束缚组小鼠同前造成急性胃溃疡，实验前30 min分别腹腔注射含10 mg VX765的DMSO、PBS混合液（12.5 μmol/kg）及含20 mg雷贝拉唑的PBS、DMSO混合液（40 mg/kg）。冷束缚实验结束后4 h，采用ELISA法测定血清TNF－α、IL－6含量，观察胃组织的大体情况、评估溃疡指数、行HE染色观察胃组织的病理学变化，采用蛋白质印迹法检测胃组织中IL－1β、IL－18及剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1的相对表达量。正常对照组小鼠于相同时相点同前检测。对数据行单因素方差分析、Bonferroni检验。结果正常对照组小鼠血清中TNF－α和IL－6含量和胃组织中剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1、IL－1β、IL－18含量均明显低于冷束缚组（P值均小于0.01）。VX765预处理＋冷束缚组小鼠血清和胃组织中的前述炎性指标含量均明显低于冷束缚组（P值均小于0.01） 。雷贝拉唑预处理＋冷束缚组与冷束缚组小鼠血清和胃组织中的前述炎性指标含量比较，差异均无统计学意义（P值均大于0.05）。VX765预处理＋冷束缚组小鼠血清和胃组织中的前述炎性指标含量均明显低于雷贝拉唑预处理＋冷束缚组（P值均小于0.01）。正常对照组小鼠胃黏膜表面光滑平整，黏膜细胞形态正常、结构清晰。冷束缚组小鼠多发性胃黏膜出血，黏膜细胞排列混乱，坏死组织周围有大量炎性细胞浸润。VX765预处理＋冷束缚组、雷贝拉唑预处理＋冷束缚组小鼠胃黏膜出血数目显著减少、黏膜结构尚完整，坏死组织周围有少量炎性细胞浸润。正常对照组、冷束缚组、VX765预处理＋冷束缚组、雷贝拉唑预处理＋冷束缚组小鼠的溃疡指数分别为0、18.7±1.1、6.3±1.5、8.2±1.3；其中正常对照组明显低于其余3组（P值均小于0.05），VX765预处理＋冷束缚组与雷贝拉唑预处理＋冷束缚组相近（P〉0.05），该2组均明显低于冷束缚组（P值均小于0.05）。结论VX765可以有效阻断半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1的活化、减少炎症因子的生成、减轻炎症反应，对冷束缚诱导小鼠急性胃溃疡胃黏膜有一定的保护作用。