银杏内生真菌的分离及其对苹果腐烂病病原菌的拮抗作用

采用组织块分离法、单菌丝挑取法,从采自3个不同地点的银杏(Ginkgo bilobaL.)叶和茎部中分离出16株内生真菌,对其进行了抗菌活性的初步研究.结果表明:有9株能够抑制苹果腐烂病病原菌的生长,其中4株菌对病原菌有显著的抑制作用,并大于同样条件下拮抗培养的瑞氏木霉的抑菌效果.与苹果腐烂病病原菌进行两点对峙培养,经镜检发现,与拮抗内生菌一起培养的病原菌的菌丝生长都出现不同程度的畸形和断裂.可见,银杏中的内生真菌对苹果腐烂病有明显的抑制作用.

天山野苹果林苹果小吉丁与苹果腐烂病复合危害研究

【目的】研究野苹果林受害与苹果小吉丁及苹果腐烂病复合危害关系,为科学防控提供理论基础。【方法】以苹果小吉丁危害级别代表值(X1)和苹果腐烂病危害级代表值(X2)分别作为自变量,以野苹果受害等级代表值(Y)作为因变量,应用SPSS19.0软件,进行回归分析。【结果】苹果小吉丁危害等级代表值和苹果腐烂病危害等级代表值与野苹果受害等级代表值间有明显相关关系,这种关系可用多元回归方程表示为Y=0.973+0.398X1+0.329X2。【结论】野苹果林同时遭受苹果小吉丁与苹果腐烂病危害时,在制定野苹果林有害生物防控技术措施上,应将苹果小吉丁与苹果腐烂病均作为防治对象。

1.2%瑞拉菌素EW对苹果树腐烂病菌的室内毒力测定和田间药效试验

用瑞拉菌素、福美砷两种杀菌剂对苹果树腐烂病病菌进行了室内毒力测定和田间药效试验。结果表明,瑞拉菌素对苹果树腐烂病病菌的抑制作用效果优于福美砷,有效中量ED50分别为28.7、35.6mg/kg;1.2%瑞拉菌素水乳剂的毒力效果是40%福美砷WP的1.24倍;1.2%瑞拉菌素水乳剂涂治后的伤口愈合率为49.94%,明显优于40%福美砷WP的伤口愈合率,其相对防效达到88.17%。

补骨脂提取物对苹果腐烂病菌的抑制作用

通过液体培养方法研究补骨脂提取物对苹果腐烂病菌菌丝生长的抑制作用,同时探究补骨脂提取物对病原菌菌丝体内几丁质酶及-β1,3葡聚糖酶活性的影响。结果表明:当补骨脂提取物浓度为5,10,20,40,80 mg·L-1时,对苹果腐烂病菌菌丝干重的抑制率分别为39.8%,62.3%,79.4%,90.6%,98.3%;用50mg.L-1补骨脂提取物处理在液体培养3d的苹果腐烂病菌,处理后1,3,6,12h菌体内几丁质酶活性分别为对照的1.32,3.62,3.34,2.47倍;β-1,3葡聚糖酶活性分别为对照的4.78,9.98,5.83,3.53倍。由此表明,补骨脂提取物对苹果腐烂病菌具有明显的抑制作用。

抗苹果树腐烂病解淀粉芽孢杆菌TS-1203的抑菌活性物质稳定性及抑菌谱测定

【目的】研究将抗苹果树腐烂病解淀粉芽孢杆菌TS-1203开发成高效低毒生防制剂的潜力.【方法】采用生长速率法测定解淀粉芽孢杆菌TS-1203的生长曲线和抑菌活性物质稳定性.【结果】解淀粉芽孢杆菌TS-1203生长曲线呈"S"型,13h后进入对数生长,43h后趋于稳定期;物理因素光照、温度与紫外照射对抑菌活性物质影响不大,只有当温度与紫外照射时间分别为100℃、60s时,其粗提液对苹果树腐烂病菌(Valsa mail)抑菌率显著下降,与对照达到显著差异水平(P<0.05);化学因素中,只有强酸强碱,金属离子为Mg^(2+)时,其抑菌率显著下降,与对照达到显著差异(P<0.05);不同饱和度硫酸铵对粗提液抑菌率影响也不明显;粗提液抑菌谱测定发现其对多种病原菌有抑制作用,其中对立枯丝核菌和链格孢抑菌率均达80%以上.【结论】解淀粉芽孢杆菌TS-1203粗提液有良好的稳定性,且抑菌谱广.

苹果树腐烂病菌生长发育相关突变体筛选及侧翼序列分析

由弱寄生菌苹果黑腐皮壳属真菌(Valsa mali Miyabe et Yamada)引起的苹果树腐烂病是苹果枝干上的重大病害。探究病菌生长发育的分子机制对于新农药靶标位点的开发具有重要理论意义。在前期建立的苹果树腐烂病菌ATMT突变体库的基础上,利用PDA培养基常规培养法,对野生型菌株03-8及230株供试突变体菌株的菌落形态、大小以及繁殖体产生情况进行观察分析,筛选得到表型发生变化的突变体共67株(占突变体总数的29.13%)。其中11株突变体的菌落大小异常(4.78%);25株突变体的菌落颜色发生变化(10.87%);18株突变体的菌落边缘变为不规则(7.83%);9株突变体的繁殖体最初形成时间推迟至50d左右(3.91%);17株(7.39%)突变体的繁殖体产生数量发生显著变化。利用TAIL-PCR对10株表型变化的突变体进行侧翼序列扩增,获得3条T-DNA侧翼序列,序列分析发现1个为细胞色素氧化酶1(cytochrome oxidase 1),其他2个均为含有核糖体L34(Ribosomal L34)的假想蛋白。筛选获得67个生长发育受到影响的突变体,并鉴定得到2个候选的调控病菌生长发育的相关基因,为揭示苹果树腐烂病菌生长发育的分子机理奠定基础。

生防菌Hhs.015对苹果枝条皮层内生细菌区系的影响

【目的】用生防菌Hhs.015发酵液处理苹果发病枝条,研究其对树体微生态的影响。【方法】采用改良CTAB法提取样本中的总DNA,对细菌群落的16S r DNA的V4+V5区进行高通量测序,研究发病枝条涂抹Hhs.015菌悬液30 d后树皮内细菌区系组成变化,分析其相对丰度以及多样性指标。【结果】在属水平上,生防菌处理样本与对照样本中的细菌种类显现出明显差异,生防菌处理组Gluconobacter丰度明显升高,放线菌门菌株丰度高于对照组,Burkholderia和Luteibacter等可能与致病相关的菌属丰度大幅下降。刮去外皮后取样,糖丝菌属(Saccharothrix)丰度仍处于较高水平。【结论】Hhs.015能够在苹果树皮内定殖,并影响苹果枝条皮层细菌区系。

大戟狼毒石油醚提取物对苹果树腐烂病抑菌活性初步研究

探索大戟狼毒的杀菌活性及活性成分,为新型植物源杀菌剂的研制和开发提供依据,以苹果树腐烂病原菌为供试菌种,用生长速率法测定了大戟狼毒石油醚提取物的对病原菌的抑制率。结果表明:大戟狼毒石油醚提取物对苹果树腐烂病菌病原菌丝生长有一定的抑制作用。其中提取物为2 g.L-1的稀释液对苹果树腐烂病菌病原菌丝生长的抑制作用最好,抑制率最高达到94.0%。大戟狼毒提取物对苹果腐烂病菌具有很好的防治效果,极具有开发潜力。

苹果腐烂病病菌对银泰的抗药性风险评估

在室内用20％银泰EC对苹果腐烂病菌（Valsa mali）进行抗药性培育，从而测定该菌对20％银泰EC产生抗药性的风险。结果表明，在连续抗性培育30代后，苹果腐烂病菌未对银泰产生抗药性，F30代对F0代的抗性比值为0．897，而且其它各代抗性比值基本在0．8～1．0之间，抗性比值保持在一个比较恒定的水平，说明苹果腐烂病菌对20％银泰EC不易产生抗药性。试验同时表明，20％银泰EC对10％银果EC存在负交互抗性，银果对F30代的EC50较对F0代的EC50显著降低，抗性比为0．612，因此在防治苹果腐烂病时具有很好的互补性，可以交替轮换使用，而且会表现更好的防治效果。

苹果腐烂病菌VmHMG基因敲除突变体获得及表型分析

苹果腐烂病菌是引起我国苹果腐烂病的主要病原真菌,对苹果产业造成了严重的经济损失。为有效控制病害的发生,本试验研究了VmHMG对苹果腐烂病菌的生长发育及致病性的影响。本研究通过融合PCR技术将苹果腐烂病菌HMG-box基因上下游片段与及潮霉素筛选标记基因Hpt片段,构建敲除载体,利用聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化,再经潮霉素初筛、PCR扩增和Southern杂交验证,最终从95个转化子中得到2株敲除突变体Δ1-5、Δ2-22,敲除效率为2.1%。与野生菌株相比,Δ1-5、Δ2-22在菌落颜色、子实体产生等方面没有发生明显变化;突变株平均生长速率分别下降了10.8%和19.8%,但致病性分别增加了48.5%和56.2%。由此可知,VmHMG基因缺失抑制了苹果腐烂病菌的生长,增强了其致病性,对其他性状影响不明显。本研究通过获得VmHMG基因敲除突变体,初步分析了该基因的功能,为明确病菌的生长发育及致病作用机制奠定了理论基础。

苹果树腐烂病菌挥发性代谢物及其毒素活性

研究苹果树腐烂病菌代谢产生的挥发性物质及其毒素活性。通过在树皮培养基中培养苹果树腐烂病菌,采用普通蒸馏法收集其培养滤液中的挥发性代谢产物,利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分离各个成分,将各组分质谱图与数据库标准物质质谱图对比,初步进行结构定性,并利用苹果枝条对其标准物质进行毒素活性测定。结果表明,苹果树腐烂病菌在发酵过程中产生5种挥发性物质,分别为2-氟丙烯、异戊醇、2-苯乙醇、4-乙基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚,其中异戊醇、2-苯乙醇、4-乙基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚均对苹果树枝具有毒素活性。苹果树腐烂病菌产生的挥发性代谢产物对苹果树具有毒素活性,为苹果树腐烂病菌致病机理的探索提供新的思路与方向。

苹果树腐烂病菌β-葡萄糖苷酶基因的克隆及表达分析

为探究苹果树腐烂病菌β-葡萄糖苷酶基因VmGluI的序列特征及其在病菌侵染致病过程中的表达,以强致病力菌株LXS080601为材料,利用RT-PCR技术克隆基因c DNA序列,通过生物信息学软件对VmGluI编码蛋白的系统进化关系、理化性质和二级结构进行分析,采用实时荧光定量PCR技术测定VmGluI的表达量。结果显示,苹果树腐烂病菌VmGluI的开放阅读框为1 689 bp(GenBank登录号KY646110),编码562个氨基酸,蛋白分子量62.7 k Da。VmGluI编码的蛋白具有糖基水解酶1家族的保守功能域,其二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,β-转角较少。VmGluI编码氨基酸序列与苹果和梨树腐烂病菌β-葡萄糖苷酶基因(KUI68239.1和KUI56905.1)同源性最高,分别为98.7%和87.8%,而与非植物病原真菌β-葡萄糖苷酶基因亲缘关系较远。接种苹果树腐烂病菌的富士枝条中,VmGluI显著上调表达,推测其在腐烂病菌侵染致病过程中起重要作用。离体枝条接种48 h后基因表达量开始显著升高,72 h时表达量最高为对照6.3倍;活体枝条接种12 h后,基因表达量已为对照的11.2倍,接种后48 h基因表达出现低谷,但96 h时表达量为对照的16.8倍,表明苹果树腐烂病菌在侵染离体和活体枝条过程中,VmGluI表达水平和时序变化存在明显差异。

腐烂病菌侵染对苹果愈伤组织防御酶活性及丙二醛含量的影响

以苹果树腐烂病菌LXS080601、感病苹果品种‘富士’和抗病砧木‘平邑甜茶’愈伤组织为材料,测定腐烂病菌侵染后,愈伤组织内过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性及丙二醛（MDA）含量的动态变化。结果显示,接种LXS080601后,‘富士’愈伤组织的发病严重度和病情指数均明显大于‘平邑甜茶’;感病品种MDA含量上升速度快,于接种后3 d增幅为28.02%,且变幅较大,为–0.32%~36.39%,而抗病砧木MDA含量变化较小,仅为–2.17%~7.46%。同时,腐烂病菌侵染提高了愈伤组织内4种防御酶活性,接种后1~2 d,PPO和POD酶活性达到高峰,接种后3~4 d,PAL和SOD酶到达活性高峰;除PPO外,‘平邑甜茶’PAL、SOD和POD酶活性变化均明显高于‘富士’,且整个侵染过程酶活性维持在较高水平,而‘富士’体内3种酶活性快速下降至对照水平,表明‘平邑甜茶’通过提高抗氧化酶活性减少体内活性氧的积累,降低膜脂过氧化产物MDA的形成,增强了对腐烂病菌侵染的抗性。

苹果树腐烂病菌对甲基硫菌灵、苯醚甲环唑和嘧菌酯的敏感性及交互抗性

【目的】明确山西省苹果树腐烂病主要致病菌Valsa mali对甲基硫菌灵、苯醚甲环唑和嘧菌酯3种常用防治药剂的敏感性，为苹果树腐烂病化学防治提供依据。【方法】采用菌落生长速率法测定了山西省8个苹果产区分离到的53个黑腐皮病菌V.mali菌株对3种杀菌剂的敏感性。【结果】3种杀菌剂E50范围依次为0．013—1．027mg／L（均值为0．516mg／L）、0．042—41．372mg/L（均值为7．509mg／L）和0．003～0．309mg／L（均值为0．035mg／L）.【结论】频次正态分布敏感性聚类分析表明：V．mali菌株群体对甲基硫菌灵的EC50呈近正态分布，以EC50均值作为甲基硫菌灵的相对敏感基线，未检测到甲基硫菌灵抗性菌株；V．mali菌株出现了对嘧菌酯和苯醚甲环唑敏感性降低的亚群体。敏感性聚类分析结果表明：山西省苹果树腐烂病菌株对药剂的敏感性无地域性差异。交互抗性分析结果表明：3种药剂两两间无交互抗性。

异补骨脂查尔酮对苹果腐烂病菌菌丝形态及细胞结构的影响

[目的]为开发新型高效的植物源杀菌剂,研究补骨脂活性成分异补骨脂查尔酮对苹果腐烂病菌菌丝形态和细胞结构的影响。[方法]采用扫描电镜和透射电镜观察法。[结果]异补骨脂查尔酮药剂处理可使菌丝体形态发生明显变化,2 mg/L异补骨脂查尔酮药剂处理后,苹果腐烂病菌菌丝尖端萎缩,菌丝体粗细不均匀,有膨大缢缩现象,菌丝体排列不整齐,菌丝之间相互缠绕,有溶融现象,且溶融部分细胞壁上有空洞,明显可见菌丝体的畸变与细胞壁的损伤;10 mg/L异补骨脂查尔酮药剂处理后,苹果腐烂病菌细胞壁严重破坏,线粒体膜、细胞核核膜及细胞膜界限不清晰,细胞质物质明显凝缩、外渗,细胞内液泡明显增多。[结论]异补骨脂查尔酮主要作用于苹果腐烂病菌的细胞壁及膜系统,同时伴有细胞老化现象。