以CGRP为靶点的单抗药物的电荷变异体表征研究

目的对抗降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)单抗及其电荷变异体进行充分表征分析。方法以抗CGRP单抗为研究对象,利用离子交换色谱对抗CGRP单抗电荷变异体进行分离收集,再利用液质联用技术(LC-MS/MS)从分子量、轻重链亚基以及翻译后修饰等方面对抗CGRP单抗和收集到的组分进行表征。结果利用离子交换色谱(IEC)仪器收集到抗CGRP单抗的电荷变异体分为主峰、酸性峰组(A1-A3)和碱性峰组(B1-B4)。质谱鉴定的抗CGRP单抗的相对分子质量为147103(主要糖型A2G1F,A2G0F);糖肽水平上的分析发现,含有N糖基化修饰的肽段序列为“TKPREEQFNSTYR”,糖基化位点为N296。酸碱变异体组分的N糖型修饰中A2G0F(>30%)和A2G1F(>35%)占比最大,并且酸性变异体中均存在唾液酸修饰;在所有组分中均检测到脱酰胺存在,酸性变异体脱酰胺比例较高;重链第109位,抗体骨架区FR区域上的色氨酸残基发生氧化的比例最高,并且酸性变异体发生氧化的比例总体高于碱性变异体;酸性变异体组分发生焦谷氨酸环化的比例远高于碱性变异体组分;抗CGRP单抗的赖氨酸(K)糖化位点比较丰富,轻链K188位点和重链K149、K245位点的糖化比例相对较高。结论通过表征分析发现,抗CGRP单抗酸性变异体的唾液酸修饰、氧化和焦谷氨酸环化发生比例高于碱性变异体,并且成功鉴定了各修饰发生的位点以及相对丰度。这些信息有助于评估是否需要进一步的药物强制降解研究和制定合理的的药物质量控制方法。

斜纹夜蛾水通道蛋白1(AQP1)基因的克隆、分子特性和表达分析

水通道蛋白(aquaporin,AQP)是生物体中一种重要的跨膜通道蛋白,它通过一些中性小分子化合物的运输,从而参与了昆虫对食物中水分再吸收、抗寒和抗干燥等重要生理机制。为研究斜纹夜蛾中水通道蛋白的基因特征和时空表达特征,本研究利用同源克隆和RACE技术获得了斜纹夜蛾水通道蛋白1(AQP1)基因的两个转录异构体,并将其分别命名为SL-AQP1A(GenBank登录号:KC999953)和SL-AQP1B(GenBank登录号:KC999954),其中SL-AQP1B比SL-AQP1A在推导的编码区5'端连续性缺失81个碱基,而其他序列完全一致;同源分析显示推导的SL-AQP1与家蚕为代表的水通道蛋白1具有较高的同源性。拓扑学和三级结构模拟显示其有经典的6个全跨膜结构域、2个半跨膜结构域、2个保守的NPA(asparagine-proline-alanine,天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸)结构基序及选择性水孔构件ar/R(aromatic arginine,芳香族精氨酸)。qRT-PCR结果显示,SL-AQP1整体时空表达差异性十分明显,并且SL-AQP1B的表达量显著高于SL-AQP1A;SL-AQP1在卵期和预蛹期有较高的表达量,在中肠、马氏管、血淋巴、消化腺中有相对较高的表达量,暗示其在斜纹夜蛾中存在重要的渗透压调节作用。本文结果为进一步研究水通道蛋白在斜纹夜蛾中的作用提供了一定的分子基础。

短芒大麦耐盐变异体的筛选与鉴定

从短芒大麦的幼穗、幼胚和成熟胚诱导出愈伤组织，建立了胚性悬浮细胞系，再以悬浮培养细胞为材料，结合诱变剂甲基磺酸乙酯处理，在含盐培养基上筛选，得到耐１．２％ＮａＣｌ的耐盐变异体，将耐盐系转入无盐培养基中培养５代，再转入含盐培养基中，仍具有耐盐性。耐盐系的生理生化分析表明，愈伤组织的耐盐极限在１．５％ＮａＣｌ，耐１．２％ＮａＣｌ的愈伤组织的游离脯氨酸含量为对照的６．６８倍，说明脯氨酸参与了植物组织对盐胁迫的调节。相对电导率比对照小２９．９２％，说明耐盐愈伤组织的膜透性比非耐盐愈伤组织小，证实其耐盐力强。耐盐愈伤组织经过分化，获得少量耐盐植株，经耐盐鉴定，耐盐浓度可达４．０４％。

草木樨状黄芪抗甲硫氨酸变异系的离体筛选及鉴定

通过组织培养体系进行了草木樨状黄芪(Astragalus melilotoides Pall.)抗甲硫氨酸变异系的筛选。无菌苗幼茎切段诱导的愈伤组织经NaN_3诱变后,经过筛选获得了抗14mmol/L甲硫氨酸的变异细胞系,并分化出大量植株。再生植株已经在大田中开花结实。经分析表明:抗性细胞系脱离选择压6个月后,放在含15mmol/L甲硫氨酸的培养基上培养25天后,其相对增长率是对照的10.2倍。抗性系再生植株游离甲硫氨酸是对照的2.12倍,并且天冬族氨基酸都有明显增加。SDS-PAGE及过氧化物酶同工酶分析表明:在蛋白质及同工酶酶谱上抗性系再生植株均出现与对照不同的差异。

苹果蠹蛾几丁质脱乙酰基酶2的基因克隆、表达模式和分子特性

【目的】研究苹果蠹蛾(Cydia pomonella)几丁质脱乙酰基酶2(chitin deacetylase 2,CDA2)的分子特性和表达模式,为新型杀虫剂靶标筛选提供理论依据。【方法】基于苹果蠹蛾转录组和基因组数据,通过同源比对获得苹果蠹蛾CDA2的相关信息;新鉴定的CpCDA2a和CpCDA2b与其他昆虫中已鉴定的CDA2氨基酸序列进行多序列比对,并采用MEGA7软件邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统发育树;通过生物信息软件预测CpCDA2a和CpCDA2b两个剪切体的蛋白功能域和三维结构并分析其差异,并通过在线软件对其分子量、等电点和亲/疏水性等蛋白理化性质及糖基化修饰位点等方面进行分析比较;采用荧光定量PCR检测CpCDA2a和CpCDA2b两个剪切体在苹果蠹蛾不同发育时期及其幼虫不同组织的表达情况,以及注射蜕皮激素后其表达量的变化趋势。【结果】获得了苹果蠹蛾CDA2的两个可变剪切体CpCDA2a和CpCDA2b的全长CDS序列及其内含子和外显子位置信息;分析发现两个剪切体的蛋白序列均具有信号肽、几丁质结合域(ChBD)、低密度脂蛋白受体域(LDLa)和几丁质脱乙酰基催化域(CDA)等功能域。多序列比对和聚类分析结果表明,不同昆虫间CDA2差异剪切类型非常类似,相同目昆虫的序列以较高的置信度聚为一支。三维结构模拟与比较发现两个剪切体的ChBD功能域在结构上存在较大差异;理化性质分析显示两个剪切体的亲/疏水性和糖基化位点也存在差异。不同发育时期表达量分析表明,CpCDA2a主要在幼虫期高表达,CpCDA2b主要在蛹的前期和中期高表达,而且在幼虫蜕皮前和蜕皮后CpCDA2a和CpCDA2b表达量均会显著上调;不同组织的表达量分析表明,CpCDA2a和CpCDA2b均在表皮中表达量最高,而CpCDA2b在头部的表达量也较高。对注射蜕皮激素后幼虫中CpCDA2a和CpCDA2b表达量分析显示,与对照相比在注射蜕皮激素后CpCDA2a的表达量在24 h和48 h均有所上调,但差异不显著,而CpCDA2b在24 h和48 h均显著上调。【结论】苹果蠹蛾CDA2的转录本存在两个可变剪切体CpCDA2a和CpCDA2b,根据对其分子特性、发育阶段和组织表达谱、以及注射蜕皮激素后表达动态等方面的综合分析,推测两者均参与苹果蠹蛾蜕皮和新表皮形成过程,但由于可变剪切的序列差异导致的蛋白结构和理化性质上的差异造成了两者在功能上的分化。

一种治疗用抗体偶联药物电荷异构体的分离和表征

目的探究一种治疗用抗体偶联药物NCB001电荷异构体结构及其对生物学活性的影响。方法采用阳离子交换色谱对NCB001电荷异构体组分进行分离和收集,通过液质联用(LC⁃MS/MS)技术进行结构表征,并进一步考察其生物学活性。结果分离获得的3种电荷异构体纯度较高(接近90%)、相对分子质量正确;3种电荷异构体发生翻译后修饰的位点相同,但与主峰相比,酸性峰中天冬酰胺的脱酰胺化修饰比例显著增高,碱性峰中重链C端甘氨酸缺失后脯氨酸的酰胺化修饰的比例明显升高,并且偶联毒素小分子药物比例明显降低;其他翻译后修饰比例无显著差异。同时,3种电荷异构体之间结合活性和细胞活性无显著差异。结论电荷异质性不会影响NCB001的生物学活性,3种电荷异构体均应视为合格的药物有效成分。

一起新型冠状病毒暴发疫情的基因组特征与溯源分析

目的:了解引起河南省2021年11月COVID-19暴发疫情的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)基因组特征,分析核苷酸和氨基酸变异情况并进行溯源。方法:收集病例急性期咽拭子标本,应用实时荧光RT-PCR方法对SARS-CoV-2核酸进行检测。选取SARS-CoV-2核酸阳性样本进行高通量基因序列测定和全基因组序列比对分析。结果:核酸检测显示,70例阳性标本ORF1ab基因Ct值的中位数为26.41(15.58~39.27),N基因Ct值的中位数为24.43(12.04~39.74)。测序结果显示,同武汉参考株(NC_045512)序列相比,测序成功的63例本土病例SARS-CoV-2基因组序列存在47~49个核苷酸突变位点,共享47个突变位点和41个氨基酸变异位点,其中S蛋白区核苷酸突变位点9个,氨基酸变异位点为12个。指示病例与河南省10月14日俄罗斯输入病例和江西省10月本土病例共享47个突变位点,基因组高度同源,属于VOC/Delta变异株(AY.122进化分支)。结论:应对境外输入性COVID-19进行持续监测,适当延长隔离观察期限,降低输入性COVID-19引起本地暴发与流行的风险;通过分析病毒基因组特征及核苷酸和氨基酸变异情况,进行快速溯源,为我省后续精准防控提供有力依据。

1株鸡传染性支气管炎病毒变异株的分子特征和抗原性分析

从山东省发病商品鸡群分离鉴定了1株鸡传染性支气管炎病毒,命名为CK/CH/SD09/005。S1基因序列分析发现,该株和同期分离的16个IBV流行株与疫苗株H120和491同源性分别为65.2%和66.0%。BLAST发现,CK/CH/SD09/005株仅与GenBank中3个广东分离株同源性较高(98.6%～98.8%),并形成独立的进化群。分别以H120和491为参考株,除了广泛的点突变,CK/CH/SD09/005S1基因在多个位点发生了插入和缺失,CK/CH/SD09/005N基因仅发生了点突变,没有基因插入和缺失;M基因除了发生点突变之外,分别在16～18和7～18位发生了碱基插入。鸡胚中和试验结果显示,CK/CH/SD09/005与H120和491均有交叉中和性,抗原相关性分别为0.18和0.09,应属于Mass和793/B之外新的血清型。结果表明,IBV S1基因可同时通过点突变、插入和缺失产生变异株,增加了免疫预防的难度。

猪伪狂犬病病毒流行株HLJ-01的分离鉴定及致病性分析

【背景】自2011年以来,猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)发生变异,经典的疫苗株已不能完全抵抗PRV变异株的感染,国内多个猪场出现伪狂犬病的暴发,PRV变异毒株开始在我国大规模流行。【目的】通过分离PRV流行变异毒株,并对其进行遗传进化和致病性分析,为PRV流行病学调查及疫苗研制提供实验数据。【方法】采集黑龙江某猪场感染PRV的脑组织病料,根据GenBank PRV gE和gB保守序列设计引物,进行PCR鉴定。通过对gE和gC基因进行序列测定和遗传进化分析。利用BHK-21细胞分离病毒,采用噬斑纯化方法对病毒进行纯化。通过电镜、间接免疫荧光对病毒进行鉴定,测定病毒生长曲线并进行致病性研究。【结果】经PCR和测序鉴定分离株为PRV流行株,将其命名为HLJ-01。遗传进化分析结果显示,该分离毒株与我国近几年分离的流行变异株位于同一分支;氨基酸序列分析结果显示,gE和gC存在国内流行变异株的特征序列,表明该分离毒株为流行变异株。生长曲线显示,分离株HLJ-01在感染48 h时滴度最高(108.5 TCID50/mL)。电镜观察结果显示,病毒颗粒直径约150 nm,呈球形,有囊膜,囊膜外有放射状纤突,呈现典型PRV病毒特征。动物感染实验结果显示,107.0 TCID50剂量感染组死亡率为100%;106.0 TCID50剂量感染组死亡率为80%;105.0 TCID50剂量感染组死亡率为60%。仔猪在接种病毒后均出现PRV感染的典型症状和病理变化,证实分离毒株对仔猪有较强致病力。【结论】分离获得一株猪伪狂犬病毒,经鉴定该分离株为流行变异株,而且具有较强的致病力,这为PRV流行病学分析及疫苗候选株的筛选奠定了基础。