Effects of recombinant adeno-associated viruses expressing human vascular endothelial growth factor 165 on spinal cord injury

Numerous studies have confirmed that vascular endothelial growth factor （VEGF） improves the function of neural cells following spinal cord injury （SCI）. However, some studies have also verified that VEGF cannot significantly induce the increase in vascular density at or surrounding the lesion, and that VEGF therapy exacerbated secondary damage following SCI. Based on the dual effects of VEGF on SCI, we constructed the recombinant adeno-associated viruses （rAAV）-hVEGF165-IRES-human recombinant green fluorescent protein （hrGFP） （AAV-VEGF） and rAAV-IRES-hrGFP （AAV-GFP）. Our results suggested that rAAV expressed hVEGFles, and a low dose of VEGF relieved increased vascular permeability, improved microcirculation in the local spinal cord, lessened spinal cord edema, and decreased neuronal apoptosis. These results verified that the releasing effects of the rAAV virus vector had protective effects on the spinal cord.

水蛭提取液对凝血酶诱导血管内皮细胞释放凝血因子的影响

目的 观察水蛭提取液对凝血酶诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）释放血管性血友病因子（vWF）、纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）、组织型纤溶酶原激活物（t-PA）的影响,探讨水蛭抗凝的作用机制.方法 体外培养 HUVECs,将生长良好的2～3代细胞分为对照组、凝血酶刺激组及水蛭提取液高、中、低剂量组5组.将生药浓度600、300、150 mg/L的水蛭提取液加入到10 kU/L凝血酶刺激的HUVECs培养12 h,对照组加等量RPMI 1640培养液.用酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞培养上清液中vWF、PAI-1、t-PA的含量.结果 与对照组比较,凝血酶刺激组细胞培养上清液中vWF、PAI-1（μg/L）含量显著升高[vWF：（11.01±0.54）%比（7.05±0.49）%;PAI-1：72.26±0.85比55.89±1.26,均P〈0.01],t-PA（μg/L）含量显著降低（15.15±1.41比34.29±1.22,P〈0.01）.与凝血酶刺激组比较,水蛭提取液高、中、低剂量组vWF、PAI-1含量[vWF：（9.48±0.64）%、 （8.57±0.50）%、 （7.97±0.44）%;PAI-1：58.30±0.90、 62.69±1.01、 67.47±1.28]显著降低,t-PA含量（32.59±1.46、 26.40±0.82、 21.06±1.13）显著升高（均P〈0.01）.说明水蛭提取液能显著减弱凝血酶诱导HUVECs释放vWF、PAI-1,增强凝血酶促进HUVECs表达t-PA.结论 水蛭具有明显的抗凝作用,其作用机制可能为参与调节内皮细胞释放vWF,调节纤溶平衡及保护受损的血管内皮细胞.

糖皮质激素瘤内注射治疗婴幼儿血管瘤机理的研究

目的:探讨糖皮质激素治疗婴幼儿血管瘤的机理.方法:对50例不同组别血管瘤(治疗显效组18例,无效组17例,未治疗组15例)及16例正常皮肤标本进行:①凋亡研究:光镜及透射电镜下观察组织形态学变化;TUNEL法检测血管内皮细胞(VEC)的凋亡水平;IHC法检测凋亡调控基因bcl-2,c-myc的表达;②增殖水平研究:IHC法检测PCNA.结果:①组织形态学变化:光镜下各组均无明显炎症及坏死征象,透射电镜观察显效组有较多VEC凋亡征象.②VEC增殖及凋亡:显效组VEC的凋亡水平显著高于无效组、未治疗组及正常皮肤组(TUNEL:47.86±3.14,22.05±3.93,19.20±2.82,35.51±3.81,P<0.01),而增殖水平明显低于上述三组(PCNA:10.25±3.89,44.33±5.01,56.32±4.12,17.91±3.76,P<0.01).③凋亡调控情况:显效组bcl-2表达显著低于无效组和未治疗组(21.28±4.70,49.96±5.33,52.51±7.69,P<0.01);c-myc表达也明显低于后两组(25.20±5.01,51.81±5.68,56.28±6.92,P<0.01).结论:①糖皮质激素可能通过诱导VEC凋亡及抑制其增殖而促进血管瘤消退.②糖皮质激素对VEC凋亡的影响可能与其下调bcl-2和c-myc的表达水平有关.

VEGF_(121)转染对诱导后血管内皮细胞增殖的影响

目的探讨VEGF基因转染对VEGF诱导后血管内皮细胞生物学功能的影响,为组织工程血管构建提供血管内皮细胞的可能性。方法应用VEGF体外诱导兔骨髓间充质干细胞定向诱导分化成血管内皮细胞后,再通过脂质体介导的方法将pCDI/VEGF121转染分化后的血管内皮细胞,通过MTT及流式细胞仪检测转染前后细胞的增殖与凋亡能力。结果诱导培养2周后兔骨髓基质细胞转化为血管内皮细胞,VEGF基因转染血管内皮细胞后表达VEGF蛋白,转染后细胞增殖能力增加,凋亡能力下降。结论转染VEGF是促进VEGF诱导血管内皮细胞增殖的有效途径,可望为组织工程血管构建提供血管内皮细胞衬层,为人工血管内皮化开辟一种新的途径。

重组人血管内皮抑制素的抗肿瘤活性研究

目的观察重组人内皮抑素的抗肿瘤活性及对血管内皮细胞增殖的抑制作用。方法以重组人内皮抑素作用于小鼠移植性肿瘤模型及人癌裸鼠移植性肿瘤,观察其对肿瘤生长的抑制效果,并与传统细胞毒性药物进行比较;同时,以MTT法观察其对血管内皮细胞ECV细胞和结缔组织类成纤维细胞L929细胞的生长抑制作用。结果重组人内皮抑素对小鼠移植性肿瘤Lewis肺癌及人癌裸鼠移植性肿瘤QGY肝癌、A549肺癌、Bcap37乳腺癌均有明显的肿瘤抑制作用;MTT实验显示重组人内皮抑素对血管内皮细胞及结缔组织类成纤维细胞具有生长抑制作用。结论重组人内皮抑素具有一定的抗肿瘤效果,其作用机理可能在于抑制肿瘤血管内皮细胞的增殖。

不同浓度葡萄糖对人血管内皮细胞的影响

目的研究高浓度葡萄糖对人血管内皮细胞的影响。方法在人脐静脉内皮细胞株ECV304培养基中分别加入5.5、20、40 mmol/L葡萄糖,作用24~72 h。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色（MTT）法观察细胞增殖情况,倒置相差显微镜观察细胞形态,透射电镜观察内皮细胞V304凋亡情况;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果高浓度葡萄糖能明显抑制血管内皮细胞的增殖,诱导培养的内皮细胞发生凋亡,细胞凋亡率增加,并随浓度的增高、时间的延长作用明显。结论高浓度葡萄糖能抑制培养的人血管内皮细胞增殖,促进细胞凋亡。

丹参对恶性梗阻性黄疸治疗作用的实验研究

目的研究丹参对实验性梗阻性黄疸型肝癌发展的影响。方法SD大鼠肝门部肝实质种植Walker-256癌株瘤块,建立恶性梗阻性黄疸模型。将模型鼠分成4组:生理盐水组(n=24)、肌苷+VC组(n=40)、丹参组(n=40)及5-FU组(n=40)。通过腹腔内分别注射生理盐水、肌苷+VC、丹参及5-FU,观察肝功、肝组织形态学及肝癌、癌周、临近肝叶及肺组织中增殖细胞核抗原(PCNA)、血管内皮生长因子(VEGF)及细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达情况。结果①丹参组对肝功的保护作用明显优于生理盐水组和5-FU组(P<0.01),而与肌苷+VC组相比无显著性差异(P>0.05);同时丹参组对梗阻性黄疸所致的组织形态学损害产生保护作用。②丹参组抑癌率和抑转移率均明显高于生理盐水组和肌苷+VC组(P<0.01);而与5-FU组相比无显著性差异(P>0.05)。③丹参组肝癌、癌周、临近肝组织及肺组织中PCNA、VEGF、ICAM-1的表达均低于肌苷+VC组和生理盐水组(P<0.01);与5-FU组比较,PCNA和VEGF无显著性差异(P>0.05),而ICAM-1则有显著性差异(P<0.05)。结论丹参对恶性梗阻性黄疸的肝脏损害有保护作用,而且通过抑制肝癌细胞增殖、阻碍肿瘤血管的形成及防止肝内外转移等机制而表现出抗癌作用。

人脐静脉内皮细胞清除补体攻膜复合物的机制

目的 探明内皮细胞清除补体攻膜复合物 (MAC)的途径及其清除动力学。方法 原代培养的人脐静脉内皮细胞以RH4 14荧光标记质膜双层 ,0℃组装亚溶破剂量的MAC ,37℃复苏后 ,LSCM实时监测MAC沉积诱导的质膜囊泡化形成和胞吞、胞吐情况。流式细胞仪定量检测内皮细胞表面MAC抗原的清除情况。结果 MAC沉积后 ,内皮细胞有活跃的质膜囊泡化形成 ,囊泡以胞吞和胞吐 2种方式离开细胞 ,并以前者占优。 37℃条件下 ,内皮细胞清除表面MAC的半衰期约为 5min。结论 内皮细胞可通过胞吞和胞吐 2种机制清除细胞表面沉积的MAC ,并以胞吞方式为主。

小鼠急性缺氧后肺内肥大细胞的变化

应用组织化学方法对对照组小鼠、缺氧组小鼠以及雌激素预处理缺氧组小鼠肺内肥大细胞的数量、活性、分布范型及组化性质进行了研究.结果表明,缺氧组小鼠随缺氧时间的延长,肺小动脉内皮细胞损伤加重,损伤后再给氧,内皮细胞损伤程度更严重;同时伴有肥大细胞和脱颗粒的急剧增多,均极显著高于同期对照组小鼠(P<0.01).雌激素预处理缺氧组小鼠随缺氧时间的延长,肺小动脉内皮细胞的损伤程度较缺氧组小鼠轻;肥大细胞和脱颗粒均极显著低于同期缺氧组小鼠(P<0.01).由此说明,肥大细胞可能在急性缺氧造成的肺损伤过程中起着重要作用,肥大细胞膜稳定剂(雌激素)对肺损伤可能起保护作用.

人外周血内皮祖细胞分离和诱导分化的实验研究

目的探讨人外周血内皮祖细胞和单个核细胞分离培养、诱导向内皮祖细胞分化的方法与鉴定。方法采取人外周血抗凝,用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离外周血中的内皮祖细胞和单个核细胞,于体外以细胞因子诱导单个核细胞向内皮祖细胞分化,用免疫荧光法和流式细胞仪分离鉴定单个核细胞向内皮祖细胞分化的细胞特异性标志。结果外周血内皮祖细胞和单个核细胞共同培养3d大部分贴壁密集生长,培养6d梭形细胞增多,培养12d收获细胞进行鉴定。Dil标记乙酰化低密度脂蛋白摄取率为(70.00±11.21)%,AC133,CD31,CD34,血管内皮生长因子受体鄄2和血管性假血友病因子免疫荧光染色阳性。流式细胞仪分类计数,AC133、CD31、CD34和血管内皮生长因子受体鄄2阳性细胞分别为95.80%、87.60%、1.27%和96.40%。结论外周血循环中的内皮祖细胞和单个核细胞共同培养,诱导后者分化的内皮祖细胞具有祖细胞特性且诱导分化率高。

黄芪、三七对下肢缺血患者骨髓干细胞体外分化作用的影响

目的探讨黄芪、三七对骨髓干细胞体外分化作用的影响。方法常规采集下肢缺血患者骨髓血,密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,在黄芪、三七不同浓度条件下贴壁扩增细胞。3周后行镜下细胞的形态学观察,流式细胞仪检测CD34+细胞的百分比。结果细胞呈梭形,束状排列,间杂有少量圆形细胞。与对照组比较,黄芪中剂量和低剂量组、三七中剂量组和高剂量组CD34+细胞的百分比均显著增加,差异有显著性意义(P<0.05或P<0.01)。结论黄芪、三七有促进骨髓干细胞向血管内皮前体细胞(EPC)转化和增殖的作用。

尼莫地平对氧化低密度脂蛋白诱导人血管内皮细胞凋亡的影响

目的研究尼莫地平对不同浓度氧化低密度脂蛋白诱导的人血管内皮细胞凋亡的影响。方法在人脐静脉内皮细胞株ECV304培养基中加入不同浓度氧化低密度脂蛋白和尼莫地平(1.2μg/ml),作用6-24 h。透射电镜观察内皮细胞ECV304的凋亡情况;流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率;用激光共聚焦显微镜检测钙离子浓度。结果不同浓度氧化低密度脂蛋白能明显诱导培养的内皮细胞发生凋亡,尼莫地平可显著降低氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞凋亡率(P<0.01)。结论尼莫地平对氧化低密度脂蛋白诱导的人血管内皮细胞凋亡具有保护作用。

榄香烯对过氧化氢损伤血管内皮细胞的保护作用

目的：探讨榄香烯对内皮细胞增殖的影响和对氧化损伤血管内皮细胞的保护作用。方法：体外培养内皮细胞,将不同浓度的榄香烯（1-200μg/ml）加入到细胞培养液中,用MTT法检测榄香烯对内皮细胞增殖的影响。将1 mmol/L H2O2作用于加入不同浓度的榄香烯预培养24 h的内皮细胞,继续培养1 h,以MDA、T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px、NO为检测指标。结果：榄香烯对内皮细胞的增殖呈剂量依赖性的抑制作用,而在抗氧化损伤方面,呈剂量依赖性降低MDA量,降低H2O2对抗氧化酶活力的影响,提高细胞内NO的含量,减少细胞调亡数量。结论：榄香烯可保护内皮细胞结果和功能的完整性,提高内皮细胞抗氧化能力。

复方丹参滴丸对动脉粥样硬化患者血管内皮细胞分泌功能的影响

目的研究复方丹参滴丸对血管内皮细胞分泌功能的保护作用,探讨其机制。方法选择动脉粥样硬化患者200例,入选患者实验前采空腹静脉血检测ET、PGI2、TXA2,然后给与复方丹参滴丸10丸/次,3次/d,服用3个月,再采空腹静脉血检测ET、PGI2、TXA2,自身前后对照研究。结果患者实验前的ET、TXA2明显较高,而PGI2水较低,而给与复方丹参滴丸干预后再检测ET、PGI2、TXA2,服药前相反,ET、TXA2明显降低(P<0.01),而PGI2明显升高(P<0.01)。结论复方丹参滴丸能够调整、改善血管内皮细胞分泌功能的异常状态,血管内皮细胞可能是复方丹参滴丸作用的靶点之一。

tPA和VEGF165基因共表达质粒对人血管细胞增殖的影响和纤溶作用

目的:观察组织纤溶酶原激活物(tPA)和血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)基因共表达质粒在血管平滑肌细胞(VSMC)中的表达,并研究表达产物对血管内皮细胞(VEC)和VSMC增殖的影响和纤溶作用。方法:用脂质体转染法将tPA和VEGF165的共表达质粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165转染VSMC,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附实验(ELISA)分别从mRNA水平和蛋白质水平检测tPA和VEGF165的表达;纤溶蛋白板法检测转染基因的VSMC培养基中tPA的纤溶活性;取转染pBudCE4.1/tPA-VEGF165质粒的VSMC培养基培养VEC和VSMC,用四甲基偶氮唑盐(MTT法)和流式细胞技术检测转基因VSMC的细胞培养基对VEC和VSMC增殖的影响。结果:pBudCE4.1/tPA-VEGF165转染VSMC后,RT-PCR和ELISA检测发现,tPA和VEGF165在mRNA和蛋白质水平均有表达;转基因培养基有明显促进纤溶和促VEC增殖作用,而对VSMC增殖无作用。结论:tPA和VEGF165基因共表达质粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165能在VSMC表达有生物学活性的tPA和VEGF165,为tPA和VEGF165基因转染防治移植心脏内血管狭窄奠定了基础。

人血管抑制因子Vasostatin(120～180aa)的真核表达、纯化及活性鉴定

目的利用毕赤酵母表达系统表达人血管抑制因子Vasostatin(120～180aa),经纯化后,观察其抑制血管内皮细胞增殖的活性。方法采用PCR技术扩增出人血管抑制因子Vasostatin(120～180aa)的全长cDNA序列,将其克隆至真核表达载体pPIC9K中,转化毕赤酵母KM71,以甲醇诱导表达,并进行Western blot检测及金属螯合层析纯化。采用MTT法检测纯化的血管抑制因子对血管内皮细胞增殖的抑制作用。结果重组表达质粒pPIC9K-Vasostatin(120～180aa)经菌落PCR、酶切和测序鉴定,证明构建正确。经Western blot检测可见一条特异条带,纯化后的蛋白纯度达88.76%,浓度为300μg/ml,在体外可抑制人脐静脉血管内皮细胞ECV304的增殖。结论人血管抑制因子Vasostatin(120～180aa)可在毕赤酵母中以分泌形式表达,并具有抑制血管内皮细胞增殖的活性。

血管内皮细胞生长因子基因转染骨髓基质细胞的瞬时表达与稳定表达

目的探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因修饰的大鼠骨髓基质细胞(BMCS)的表达能力及表达活性。方法取6周龄SD大鼠BMCS传代培养后以3μl阳离子脂质体(Lipofectamine):1μgpcDNA3.1-VEGF165的比例转染,通过RT-PCR技术、免疫组织化学S-P法检测转染细胞中外源性VEGF165基因的转录及瞬时表达和稳定表达,用血管内皮细胞(VEC)增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性。结果VEGF基因转染的大鼠骨髓基质细胞可有效转录VEGF165,其分泌培养上清液中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖,具有很强的生物活性。结论采用基因转染技术可将VEGF转染至BMCS中,并可有效表达具有生物活性的VEGF。

电离辐射对血管内皮细胞影响的实验研究

目的 观察电离辐射 (X线 )对血管内皮细胞培养上清液中内皮素 (ET)和一氧化氮 (NO)含量变化及细胞凋亡的影响。方法 采用新生儿脐带静脉血管内皮细胞 (HUVEC)体外原代培养方法 ,用放免法和化学法检测培养上清液中ET和NO含量 ,用透射电镜、流式细胞仪观察细胞形态特征和检测凋亡细胞。结果 血管内皮细胞在电离辐射 2 4h后 ,各辐射剂量组培养上清液中NO含量无变化 ;在 2Gy剂量组ET含量变化不明显 ,而 5、10、2 0Gy各剂量组ET含量明显下降 (P <0 .0 5 )。电离辐射 2 4、4 8h后HUVEC形态无明显改变 ,未检测出明显凋亡细胞。结论 原代培养生长的HUVEC在 2～ 2 0Gy照射时有一定的放射抗性 。

睡眠呼吸暂停低通气综合征患者血清HIF-1α、VEGF、sVCAM-1水平的变化及意义

目的探讨睡眠呼吸暂停低通气综合征(SAHS)患者血清缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、可溶性血管内皮细胞黏附因子-1(sVCAM-1)水平的变化及意义。方法 79例SAHS患者按呼吸暂停低通气指数(AHI)分为轻、中、重度组,以35例健康体检者为对照组,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清HIF-1α、VEGF、sVCAM-1的水平。对58例中、重度患者采用持续气道正压通气(CPAP)治疗,并对治疗前后炎症指标进行分析对比。结果轻、中、重度组SAHS患者HIF-1α、VEGF、sVCAM-1表达水平明显高于对照组(P<0.05),对照组分别为(18.7±8.2)pg/mL、(35.5±45.1)pg/mL、(463.1±121.1)ng/mL。HIF-1α水平中度组(33.9±9.0)pg/mL明显高于轻度组(26.5±6.4)pg/mL(P<0.05),轻、中度组间VEGF、sV-CAM-1表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。重度组HIF-1α、VEGF、sVCAM-1表达水平分别为(51.8±17.1)pg/mL、(192.2±77.8)pg/mL、(824.8±201.3)ng/mL明显高于轻、中度组,差异有统计学意义(P<0.05)。中、重度组经CPAP治疗后HIF-1α、VEGF、sVCAM-1表达水平均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 SAHS可导致患者血清HIF-1α、VEGF、sVCAM-1水平升高,且病情越重,血清HIF-1α、VEGF、sVCAM-1浓度越高。经CPAP治疗后,可明显降低HIF-1α、VEGF、sV-CAM-1的水平,改善心血管炎症病变。

他汀类药物对参与动脉粥样硬化的主要细胞成分的直接作用

他汀类药物是降脂药,它的作用机理是抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶,该酶催化HMG-CoA转化为甲羟戊酸。甲羟戊酸的代谢产物是真核细胞一系列生物活动的关键,他汀类抑制甲羟戊酸代谢通路后可产生多种效应。已发现他汀类可抑制血管平滑肌细胞(VSMC)和巨噬细胞迁移、增殖;减少VSMC中白细胞介素-6和诱导型一氧化氮合酶表达;改善内皮功能;上调内皮型一氧化氮合酶表达。他汀类的上述作用与血浆胆固醇水平无关,可以被内源性甲羟戊酸和某些类异戊二烯物质所阻断。因此除降脂作用外,他汀类药物还可作用于参与动脉粥样硬化的主要细胞成分。发挥直接的抗动脉粥样硬化作用。