SOX12基因在Vero细胞感染猪流行性腹泻病毒过程中的功能研究

[目的]探究SOX12基因对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)复制的影响,以期为抗PEDV育种提供有效分子标记。[方法]本研究合成3条SOX12基因干扰序列(siRNA1、siRNA2、siRNA3)及其阴性对照(siNC)并转染至非洲绿猴肾细胞(Vero细胞),转染48 h后收集细胞,利用实时荧光定量PCR检测干扰效率。将有效的干扰片段和siNC分别转染至Vero细胞24 h后,用感染复数为0.05的PEDV感染细胞,分为4组:感染PEDV 12 h试验组(12 hpi-siRNA)、感染PEDV 12 h对照组(12 hpi-siNC)、感染PEDV 24 h试验组(24 hpi-siRNA)及感染PEDV 24 h对照组(24 hpi-siNC),利用实时荧光定量PCR检测PEDV N及SOX12基因的表达水平,通过Western blotting检测各组细胞PEDV N蛋白表达水平,利用组织半数感染量(50%tissue culture infective dose, TCID_(50))检测PEDV的病毒滴度,并利用间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay, IFA)法检测各组细胞中PEDV复制情况。通过GeneMANIA网站预测SOX12基因的互作基因,利用实时荧光定量PCR检测抑制SOX12基因表达后其互作基因的表达变化。[结果]SOX12基因3条干扰片段的干扰效率为30%~60%,其中siRNA3干扰效率最高,可达60%。与12 hpi-siNC和24 hpi-siNC组相比,12 hpi-siRNA和24 hpi-siRNA组PEDV N基因的转录和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。病毒滴度表型测定结果表明,12 hpi-siRNA和24 hpi-siRNA组的PEDV病毒滴度显著低于各自对照组(P<0.05);IFA结果也表明,12 hpi-siRNA和24 hpi-siRNA组的PEDV复制明显少于对照组。基因互作预测及实时荧光定量PCR检测结果显示,与siNC组相比,干扰SOX12基因的表达后,其互作基因SOX17、DDX51、ZMIZ2、SSRP1、TAF6和ABCB8的表达水平均显著降低(P<0.05)。[结论]本研究揭示了SOX12基因在PEDV感染Vero细胞过程中的调控作用,发现SOX12基因的下调表达能显著抑制PEDV复制和其互作基因SOX17、DDX51、ZMIZ2、SSRP1、TAF6和ABCB8的表达。

1株悬浮培养的Vero细胞驯化及其生物学特性研究

目的 将贴壁培养的Vero细胞驯化成悬浮培养细胞,并对其生物学特性进行研究。方法 采用无血清培养和“摇床适应法”对细胞进行培养优化,对其进行成瘤性、短串联重复序列(short tandem repeat,STR)分析、透射电子显微镜形态,以及对流感病毒敏感性检测。结果 成功建立悬浮细胞系Vero-S,Vero-S细胞生长期在24~72 h,平台期在108~144h之间,衰退期在144h以后,细胞PDT为36 h,细胞密度在14.01~14.88×10^(8)个/L之间,细胞平均圆度在0.73~0.75之间,细胞直径在12.12~14.44μm之间。Vero-S细胞在裸鼠皮下形成肿瘤,而悬浮培养前的Vero细胞不具有成瘤性;STR显示为猴源细胞系;电镜下细胞结构完整;Vero-S细胞对流感病毒感染不敏感。结论 悬浮细胞系Vero-S细胞的生长经历与贴壁细胞类似的生长期、平台期、衰退期,且细胞大小均一,建立的悬浮培养基能够支持Vero-S细胞高密度生长。STR结果表明悬浮Vero细胞具有完全的遗传稳定性,透射电镜下与贴壁Vero细胞无明显区别。为细胞悬浮驯化培养技术提供参考价值,并可用于细胞致肿瘤的机理研究。

新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)内毒素检查方法比较

目的为新型冠状病毒(简称新冠病毒)灭活疫苗(Vero细胞)的细菌内毒素检查和质量控制提供技术支持和理论基础。方法利用凝胶法、光度测定法[包括动态浊度(TKA)法、微量动态显色(mKCA)法]测定并比较新冠病毒灭活疫苗(Vero细胞)原液和成品中内毒素浓度。结果3种方法测得的供试品内毒素浓度均符合规定(原液为不超过5 EU/600 SU,成品为每剂≤5 EU),且后2种方法既能用于定性检测也能用于定量检测,特别是mKCA法下鲎试剂用量更少。结论mKCA法是检查该疫苗内毒素浓度的最适宜方法,具有灵敏度高、稳定性强、鲎试剂用量少、数据完整和可追溯、人为操作误差较小的特点。

Vero及Vero-dst细胞对犬瘟热病毒敏感性比较

目的为了更好地分离犬瘟热病毒(CDV)并确诊犬瘟热,本实验比较了Vero及Vero-dst细胞对此病毒的敏感性。方法将CDV标准毒株Snyder Hill株及临床犬瘟热阳性犬组织匀浆分别接种Vero及Vero-dst两种细胞,通过观察细胞病变、检测病毒滴度(TCID50),并通过RT-PCR法进行比较,分析两种细胞对CDV的敏感性。结果接种病毒后Vero细胞盲传5代始终未见细胞病变,而Vero-dst细胞12 h出现了明显的合胞样细胞病变,且RT-PCR扩增出了CDV基因特异性片段。结论 Vero-dst细胞对CDV表现了良好的敏感性,是体外分离培养CDV的一个有效细胞系。而所本实验中使用的Vero细胞并不适于CDV的分离与培养。另外,本实验利用Vero-dst细胞从临床犬瘟热阳性病例中成功分离到了野毒株,并确定其毒力较标准毒株毒力强,可用于进一步的研究。

Prevention and Nursing of Adverse Reactions of Novel Coronavirus Inactivated Vaccine (Vero Cells)

Objective:To discuss and analyze the causes of adverse reactions caused by the inactivated novel coronavirus vaccine(Vero cells),and to propose methods of prevention and care.Methods:A questionnaire was used to randomly select 229 adults who were vaccinated with the inactivated novel coronavirus vaccine(Vero cells)at Xi’an People’s Hospital(Xi’an Fourth Hospital).The adverse reactions were statistically analyzed.Results:Among the 229 adults vaccinated with the inactivated novel coronavirus vaccine(Vero cells),30 experienced vaccination reactions.The main reaction was local induration at the inoculation site,and dizziness was the primary systemic symptom.Conclusion:To reduce the incidence of adverse reactions to the inactivated novel coronavirus vaccine(Vero cells),it is necessary to effectively evaluate the health status of adults before vaccination,select the correct vaccination site,and strictly implement the rules of 3-inspections,7-checks,and 1-verification.Standardizing the operation process and providing thorough health education after vaccination can effectively reduce the occurrence of adverse reactions.

Vero细胞疫苗生产过程中宿主细胞蛋白含量分析

目的了解Vero细胞疫苗中间产品中宿主细胞蛋白(Host cell protein,HCP)的含量变化。方法模拟Vero细胞疫苗生产工艺流程,制备Vero细胞HCP,免疫家兔制备Vero细胞HCP免疫血清,经Protein ASepharose CL-4B亲和层析,制备纯化的抗Vero细胞HCPIgG,通过SDS-PAGE和Western blot分析Vero细胞乙型脑炎疫苗及Vero细胞SARS疫苗各中间产品的蛋白、HCP及病毒抗原成分的含量变化。结果Vero细胞乙型脑炎疫苗和Vero细胞SARS疫苗中间产品中均存在一定量HCP,不同的纯化工艺均可以去除大部分HCP,随着生产工艺的进行,疫苗中间产品中HCP的含量逐渐降低,病毒成分的纯度逐渐增高,但纯化后产品中仍存在少量HCP。结论Vero细胞乙型脑炎疫苗和Vero细胞SARS疫苗均存在一定量HCP。

微载体高密度培养Vero细胞的研究

微载体是动物细胞高密度培养的有效手段。首先在硅化的方瓶中对Ｃｙｔｏｄｅｘ１、Ｃｙｔｏｄｅｘ３、Ｂｉｏｓｉｌｏｎ、Ｂｅｌｌｃｏ Ｇｌａｓｓ Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ、ＣＴ－１、ＣＴ－３、ＭＣ－１、ＣＴ－２８种国产和进口微载体进行了比较和筛选。确定以Ｂｉｏｓｉｌｏｎ作为Ｖｅｒｏ细胞高密度培养的首选微载体。用５００ｍｌ Ｗｈｅａｔｏｎ搅拌瓶探索影响Ｖｅｒｏ细胞高密度培养的条件。

国产冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的接种反应及其免疫原性

目的观察国产冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的接种反应及其免疫原性。方法观察组200例和对照组50例暴露后,按照0、3、7、14、28d免疫程序,分别接种国产、进口冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)。观察组接种疫苗后,观察全身和局部反应情况。采用快速荧光灶抑制试验(RFFIT)检测观察组和对照组接种后的血清中和抗体水平。结果观察组疫苗接种后,局部红肿、硬结、疼痛、瘙痒发生率分别1.4%、0.8%、17.1%和2.4%;全身反应发热、皮疹、头痛、疲劳乏力和其他反应发生率分别为1.2%、0.4%、2.4%、4.2%和0.3%,且在第7天完全消失。观察组与对照组疫苗首剂接种后7d,抗体阳转率分别为40.3%和37.0%,14d分别为95.5%和97.7%,差异无统计学意义;且首剂接种后45d,抗体阳转率均为100%。观察组和对照组疫苗首剂接种后7、14、45d,血清中和抗体GMT差异无统计学意义,14、45d血清中和抗体GMT均大于0.5IU/ml。结论国产冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)接种反应轻微,并具有良好的免疫原性。

Vero细胞微载体技术规模化培养轮状病毒

目的利用Vero细胞微载体技术规模化培养轮状病毒。方法利用5 L生物反应器进行Vero细胞的微载体培养,待细胞密度达1.5×106个/ml时,以0.05 MOI接种轮状病毒P[2]G3株,于37℃连续培养6 d后收获病毒,期间每天取样观察细胞病变(CPE),并检测病毒感染性滴度。结果在轮状病毒规模化培养的初期,其病毒滴度逐渐升高,至48 h达到最高。在上清中,病毒的滴度为5.5CCID50/ml;在细胞裂解产物中,病毒的滴度为3.75CCID50/ml。结论Vero细胞微载体规模化培养轮状病毒可提高病毒的滴度。

Vero细胞的微载体培养——放大过程中的接种工艺

概述了用微载体系统培养贴壁细胞放大过程中的接种方法，研究了球转球的工艺条件，并建立了球转球的动力学模型。用此方法成功地在国产５０Ｌ生物反应器中培养Ｖｅｒｏ细胞，细胞密度达１．１×１０７ｃｅｌｓ／ｍＬ。

应用生物反应器和微载体培养Vero细胞生产猪流行性腹泻病毒的研究

对应用生物反应器系统和微载体培养Vero细胞生产PEDV进行了实验研究,通过分析和比较批培养及换液培养过程中细胞生长、代谢和病毒增殖的相互关系,发现PEDV随着细胞的生长而不断在胞内增殖和积累,72h后Vero细胞需经过一个短暂的停止生长阶段,再继续呈指数生长。反应器换液培养的单位培养基细胞产量比批培养提高了28%,比方瓶培养提高了138%,疫苗生产效率显著提高。当接种密度为1 23×105cells/ml时,换液培养至96h时获得了1 74×106cells/ml的高细胞密度,细胞扩增了14 3倍,且单位细胞的病毒产量并不低于静态培养。

用微载体系统培养Vero细胞生产高滴度狂犬病毒液

目的 采用生物反应器微载体培养Vero细胞生产高滴度狂犬病毒液。方法 用 5L生物反应器培养Vero细胞 ,培养至 4d时接种CTN株狂犬病毒 ,在培养全程对细胞生长所消耗的营养物质及代谢产物进行监测及分析。结果 培养 4d后细胞浓度可达 1 2× 10 7cells ml,培养 3周后的病毒液经ELISA检测A值可达 0 2 1～1 0 6。病毒滴度达 10 - 6 0 ～ 10 - 8 0 LogLD50 ml。病毒液可连续收获 5次。结论 用微载体系统培养Vero细胞可生产高滴度的狂犬病毒液。

国产无佐剂人用Vero细胞狂犬病疫苗接种反应及免疫效果

目的观察国产无佐剂人用Vero细胞狂犬病疫苗接种反应及免疫效果。方法对93名观察对象采用0、3、7、14和28 d程序进行暴露后免疫,观察免后30 min的即时反应及72 h内的局部和全身副反应,并于第1针免疫后3、7、14和45 d采血,检测血清抗体水平。结果疫苗接种后均无异常反应,局部及全身一般反应率分别为5.8%和4.5%。免后7 d,血清抗体阳转率达22.58%,14 d达100%;免后7、14和45 d的GMT差异有显著意义;不同性别间免后14和45 d的GMT差异均无显著意义;不同年龄组间GMT14 d差异有显著意义,45 d差异无显著意义。结论国产无佐剂人用Vero细胞狂犬病疫苗安全,免疫效果好。

非典型肺炎标本感染乳鼠和Vero E6细胞的病理学观察

为查明非典型肺炎的病原体 ,作者以死亡患者肺组织感染KM乳鼠和VeroE6细胞 ,对发病鼠的主要脏器作病理学检查 ,对出现病变的培养细胞作超微结构观察 ,对细胞培养上清液作电镜负染检查。结果发现 ,患者肺组织可致乳鼠发病死亡 ,病变主要表现在肺脏和肝脏 ,在肺组织中检出病毒。在感染的培养细胞中发现大量病毒 ,在细胞培养液中也检出病毒 ,检出的病毒大多呈球形 ,直径 90～12 0nm ,其形态和细胞内分布与冠状病毒相一致 。

斑点杂交法测定Vero细胞DNA残留量的探针选择

目的:为精确检测以Vero细胞为基质的生物制品中宿主细胞残余DNA含量。方法:将提取的Vero细胞DNA分别用不同时间的超声波和 HindⅢ内切酶进行断链处理,电泳和序列分析并确定DNA片段长度,地高辛标记后制备成检测探针,测定已知的不同浓度的样品DNA和疫苗中DNA残留量。结果:HindⅢ内切酶处理断链后产生172 bp、344 bp、516 bp、688 bp不同长度的DNA,并选取172bp长度的DNA片断和超声波处理30 s的DNA长度为500～750 bp的DNA片断作为检测用探针。结论:两种方法处理的DNA探针检测DNA的灵敏度可达0.1 pg,重复性均较好,超声波处理的探针特异性优于酶切探针,并能成功的应用于疫苗产品中残余宿主细胞DNA的检测。

艰难梭菌A毒素诱导SMMC7721细胞和Vero细胞凋亡的比较研究(英文)

背景与目的:艰难梭菌是假膜性大肠炎及抗生素诱发性腹泻的主要致病菌之一,它产生的毒素具有不同的生物学活性。本实验拟研究艰难梭菌A毒素诱导人肝癌细胞株(SMMC7721)和非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)凋亡的作用。方法:由脑心浸液对艰难梭菌VPI10463菌株培养产毒,经甲状腺球蛋白亲合层析和QSephrose层析提纯得到精制A毒素。对SMMC7721细胞的研究以Vero细胞为对照。抑制细胞增殖的检测采用MTT法;用荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞仪观察细胞形态和细胞周期的改变;采用琼脂糖凝胶电泳法观测DNA碎片。结果:不同浓度A毒素(0.293～4.690mg·L-1)明显抑制了SMMC7721及Vero细胞的增殖,并且呈时间和浓度依赖性;两种细胞与A毒素共同培养48h,荧光显微镜和透射电镜都观察到典型的凋亡形态变化;SMMC7721细胞与A毒素共同培养48h后,琼脂糖凝胶电泳显示梯形条带。结论:A毒素明显诱导了两种细胞的凋亡;A毒素对SMMC7721细胞具有更强的诱导凋亡作用。

β-丙内酯在Vero细胞HFRS疫苗中的应用

目的 探讨 β -丙内酯灭活双价Vero细胞肾综合征出血热纯化疫苗的最佳条件。 方法 采用不同终浓度的 β-丙内酯和不同的灭活时间对疫苗进行灭活 ,用细胞培养法进行病毒增殖试验 ,以确定灭活效果。应用高效液相色谱法分析 β -丙内酯的最佳水解条件和 3批双价vero细胞出血热纯化灭活疫苗 β-丙内酯残留量。检测 3批双价纯化灭活疫苗的免疫效果。结果 疫苗经终浓度为 1∶2 0 0 0和 1∶4 0 0 0的 β -丙内酯作用 2 4h ,均可完全灭活病毒 ;疫苗中的 β-丙内酯在 37℃水浴下 ,随着水解时间的延长 ,其含量逐渐下降 ,水解 2h后已无 β-丙内酯检出 ;3批经 β-丙内酯灭活的双价Vero细胞出血热纯化疫苗均未检出 β-丙内酯残留 ,在家兔体内诱导产生针对汉滩型和汉城型病毒的中和抗体效价均达到 1∶2 0。结论 肾综合征出血热纯化疫苗经终浓度为 1∶4 0 0 0 β -丙内酯 4℃灭活 2 4h ,然后再于 37℃水浴中水解 2h ,既可达到完全灭活病毒且无 β-丙内酯残留的目的 ;

利用生物反应器和Vero细胞培养鸡传染性法氏囊病病毒的研究

通过对血清、pH、接毒量和收毒时间等培养条件的优化 ,确定鸡传染性法氏囊病病毒 (IBDV)在Vero细胞上增殖的最佳培养条件为 :血清 2 %,pH 7.0 ,接毒量 5∶10 0 0 0 ,收毒时间为接毒后培养 10 8h。 2 5 0ml自制搅拌瓶和 5L搅拌式生物反应器研究结果表明 ,在 2g/L微载体的Vero细胞悬浮培养系统中 ,待细胞刚长满微载体时 ,按照确定的IBDV最佳增殖条件换液培养 ,病毒可在较长一段时间维持高的病毒滴度 ,最高滴度分别可达 8.875和8.5 8(-lgTCID50 ) ,比传统转瓶生产方法至少提高 1个毒价 ,可用于IBDV规模化生产。

Vero细胞微载体悬浮培养制备人用狂犬病疫苗的研究

将“北京”及“CTN”两株中国分离的狂犬病病毒毒株适应于Vero细胞,病毒滴度可达10^(7.5)LD_(50)/ml。应用Veto细胞微载体反应器系统培养病毒,经丙内酯灭活,超滤浓缩制备的疫苗,其效力试验(NIH法)结果优于现行原代地鼠肾细胞培养疫苗。

问号钩端螺旋体诱导的Vero和J774A.1细胞的凋亡和超微结构病变

目的 :探讨不同毒力的钩体黏附和侵入宿主细胞能力及其病理变化。方法 :建立 Fontana镀银染色法用于观察问号钩体黄疸出血群赖型 5 6 6 0 1株、波摩那群波摩那型 5 6 6 0 8株和双曲钩体三堡隆群 patoc型 Patoc 株黏附 Vero和 J774 A.1细胞的能力 ;采用电镜技术观察感染细胞的超微结构病变 ;采用 FITC- Annexin V/PI荧光标记流式细胞术 ,检测紫外线灭活前后的上述钩体菌株诱导 Vero和 J774 A.1细胞凋亡或坏死的情况。结果 :问号钩体 5 6 6 0 1和 5 6 6 0 8株对 Vero细胞的黏附率分别为 2 4 .2 %和 2 2 .9% (P>0 .0 5 ) ;对 J774 A.1细胞的黏附率分别为4 9.0 %和 4 6 .9% (P>0 .0 5 ) ;双曲钩体 Patoc 株不能黏附细胞。两株问号钩体侵入细胞后形成含有钩体的特殊吞噬泡 ,并引起相似的细胞超微结构病变 ,如细胞核染色质浓缩或溶解、细胞空泡变性、线粒体肿胀及线粒体嵴消失、内质网肿胀和膜旁核糖体消失等。灭活前的 5 6 6 0 1和 5 6 6 0 8株引起的 Vero细胞凋亡率分别为 84 .4 %和 82 .8% ,灭活后则分别为 77.9%和 86 .1%。灭活前后的 5 6 6 0 1株均以诱导 Vero细胞晚期凋亡为主 ,其凋亡率分别 6 8.0 %和5 2 .9%。灭活前后的 5 6 6 0 8株均以诱导 Vero细胞早期凋亡为主 ,其凋亡率分别为 6 4.1%和 5 0 .1%