两种细胞培养流感病毒的滴度比较

目的探讨甲1(A1)型流感病毒在Vero细胞和MDCK细胞培养的可行性,确定最佳培养条件。方法将流感病毒接种于Vero细胞和MDCK细胞,在含有不同浓度胎牛血清或胰酶维持液中培养,于不同时间收获病毒液,检测血凝素滴度(HA)。结果胎牛血清对病毒的繁殖有明显抑制作用。加入适量胰酶(约5μg/ml)可提高病毒产量。最佳收获病毒时间为72～96h。在MDCK细胞上的病毒HA滴度高于Vero细胞。结论两种组织细胞培养流感病毒结果相近,Vero细胞和MDCK细胞均可用于培养流感病毒。

汉坦病毒Vero细胞灭活疫苗候选毒种筛选

目的将肾综合征出血热疫苗后备筛选毒株适应于Vero细胞，并对其抗原性和免疫原性进行研究。方法将新分离的4株汉坦病毒接种敏感动物，在乳沙鼠脑内连续传代。比较脑内病毒抗原的含量以及乳鼠的发病情况；在Vero细胞中传代，比较培养液中的病毒滴度和抗原滴度以及细胞的病变情况；利用筛选出的毒株研制Veto细胞灭活疫苗。研究疫苗的免疫原性。结果4株病毒经乳沙鼠脑内传代，鼠脑悬液的病毒滴度和抗原滴度分别达7．00～7．75LgCCID50／ml和1：3201：1280；4株毒株经Vero细胞连续传5代，培养液病毒滴度和抗原滴度分别达6．50～7．50LgCID50／ml和1：160～1：768；疫苗免疫家兔2针后，其中出血热病毒株Z34与ZJ5株疫苗免疫血清对同型毒株的中和效价达到1：10。结论ZJ4与ZJ5两毒株已适应于Vero细胞，且具有病毒滴度高和免疫原性良好的特性，适合用作Vero细胞肾综合征出血热疫苗理想的候选毒株。

轮状病毒基因重配LH9株(G4型)传代稳定性研究

对兰州生物制品研究所自行构建的轮状病毒基因重配株G4型LH9株在Vero细胞中传代的稳定性进行研究。将基因重配LH9毒株接种于Vero细胞上从7代传至17代,经电镜检查、病毒滴度测定、病毒基因组RNA电泳图谱分析、基因序列测定分析、轮状病毒型别鉴定及其它相关检定,结果均符合药典要求。证实该毒株为A群G4P〔12〕型轮状病毒,在Vero细胞传代中具有良好的稳定性,为疫苗研制提供安全有效的依据。

生物反应器培养Vero细胞的生长代谢与限制因素研究

目的研究生物反应器大规模培养Vero细胞生产疫苗细胞生长代谢与限制因素。方法采用微载体培养系统进行细胞培养,同时进行细胞记数、消化和贴壁实验。结果细胞培养过程中测得饱和溶解氧浓度系数(Cm)为0.197mM,体积氧解析系数(K1a)为0.0158min-1,同时随着葡萄糖消耗、乳酸生成,细胞停止生长并开始死亡。结论利用生物反应器培养细胞时细胞代谢与细胞密度、搅拌速率、温度通气流量、葡萄糖消耗、乳酸生成等有直接关系。

葡萄球菌肠毒素A基因原核表达系统的构建及其表达产物的鉴定

目的:构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因原核表达系统,了解重组表达产物rSEA促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长的作用。方法:采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌ATCC13565株DNA中扩增全长SEA基因片段,T-A克隆后测序,构建SEA基因原核表达系统pET32a-SEA-E.coliBL21DE3。采用SDS-PAGE检测rSEA表达量,Ni-NTA亲和层析法提纯rSEA。采用TCID50法测定rSEA对Vero细胞的细胞毒性并计算TCIC50值。采用MTT比色法分别检测不同浓度rSEA体外对小鼠脾细胞、人外周血单个核细胞(PBMC)的促增殖作用以及对HepG2细胞(人肝癌细胞)、HeLa细胞(人宫颈癌上皮细胞)的生长抑制作用。结果:与公布的相关序列比较,所克隆的SEA基因核苷酸序列相似性为100%。rSEA表达量约为细菌总蛋白的25%。rSEA对Vero细胞的TCIC50为3.14μg。1.0-20.0mg/L的rSEA对小鼠脾细胞和人PBMC均有明显的促增殖作用(P<0.05)。5.0-20.0mg/LrSEA作用的人PBMC上清均能有效地抑制HepG2细胞和HeLa细胞生长(P<0.05)。结论:成功地构建了rSEA原核表达系统。rSEA仍然具有生物学活性。所建立的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用的检测方法,为以后减毒rSEA突变体的筛选奠定了基础。

父方否决细胞对小鼠半相合干细胞移植模型移植物抗宿主病的预防作用

目的探讨父方否决细胞对小鼠半相合干细胞移植模型移植物抗宿主病(GVHD)是否起预防作用。方法以B6CF1(H-2b/d)作为半相合干细胞移植的受鼠,给予9.0Gy全身照射后4h,单纯照射组经尾静脉注射0.3mlD-Hank's液,不进行细胞移植;对照组经尾静脉注射C57BL/6小鼠混合细胞悬液(4.5×106骨髓细胞+3.0×107脾细胞),但不进行其他治疗处理;实验组于移植4d后经尾静脉注射BALB/c小鼠脾细胞悬液(数量分别为5.0×106、1.0×107),然后观察其造血恢复、植入及移植物抗宿主病(GVHD)的情况。结果由于没有给予GVHD防治措施,对照组受鼠GVHD的发生率和死亡率分别为10/10和10/10;而1/6量否决细胞组小鼠GVHD的发生率为5/10,30d生存率增加至5/10(P<0.01),5只因GVHD死亡的受鼠中位生存期为20d,较对照组(中位生存期14d)有显著性差异(P<0.05);1/3量否决细胞组小鼠GVHD的发生率为2/10,30d生存率增加至8/10,中位生存期延长至30d以上(P<0.05)。结论半相合干细胞移植后输注父方否决细胞,可以诱导特异性免疫耐受,显著降低半相合干细胞移植GVHD的发生率。

狂犬病毒CTN-1株在Vero细胞中持续感染的特性研究

目的 观察以Veto细胞大规模生产狂犬病毒时的细胞生长和病毒感染特性。方法 以分种和混种方法，经过不同培养时间，测定Vem细胞的生长状况和胞内外病毒含量。结果 细胞形态随接种病毒时间的长短有所变化，不同接种方法在病毒滴度也无显著性差异。培养上清夜病毒含量以第4～9d滴度最高，细胞病毒感染率在第4d达80％以上，第10d后开始下降，第15d降入低谷。结论 以0．01～0．10MOI的加毒比例，培养第4，9d收获效果最佳。

T否决细胞促进造血干细胞植入的研究

否决效应是一种能特异性抑制识别否决细胞自身表面抗原的细胞毒性T细胞前体细胞(CTL-p)的攻击,而CTL-p对识别第三方抗原无抑制作用。具有否决效应的细胞称为否决细胞。细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte,CD8+CTL)是现知否决活性最强的细胞。在异基因造血干细胞移植中,输注供者源的CD8+CTL否决细胞清除宿主同种异体反应细胞可以促进供者干细胞的植入。本文就近年来关于CD8+CTL否决效应的机制、GVH效应、抗肿瘤效应、活体内的应用及与药物和细胞之间的协同作用的研究进展做一综述。

VERO细胞狂犬病疫苗免疫效果的观察

目的比较氢氧化铝佐剂和无佐剂Vero细胞狂犬病疫苗免疫效果的影响。方法以常规免疫程序用氢氧化铝佐剂与无佐剂两种疫苗分别免疫豚鼠。并分别于3、7、14、30、60、90、180和360d采血并以小鼠中和法测定不同时间抗体水平。结果氢氧化铝佐剂组和无佐剂组,抗体出现时间不一致,无佐剂组稍早,阳转率于第3d已为5．0％,而佐剂组为0,两组于第60d皆达到100．0％；抗体水平两组也稍有差别,无佐剂组较高,但比较差异无显著性,在第60d达到高峰,第90d逐渐下降。结论初步显示,无佐剂Vero细胞狂犬疫苗免疫效果较佐剂组稍好。

H1N1亚型猪流感病毒血凝素基因的克隆与表达

应用RT-PCR方法扩增了1株H1N1亚型猪流感病毒的血凝素基因,并克隆到pMD 18-T Simple载体中,经PCR、酶切和测序验证克隆正确后,亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建了重组质粒pcDNA-HA。在脂质体作用下重组质粒pcDNA-HA转染Vero细胞。间接免疫荧光试验结果表明,血凝素基因在Vero细胞中成功进行了瞬时表达,这为猪流感病毒DNA疫苗的进一步研究奠定了基础。

黄热疫苗病毒17D株在Vero细胞上的适应性传代

目的 建立黄热疫苗病毒17D株的Vero细胞适应株.方法 将2批鸡胚黄热疫苗病毒在Vero细胞上进行2次蚀斑筛选,并连续传代培养,然后对获得的4株Vero细胞适应株病毒YFV-Vero（5）-A1、YFV-Vero（5）-A2、YFV-Vero（5）-B1和YFV-Vero（5）-B2进行稳定性和免疫原性检测.结果 4株Vero细胞适应株病毒可被黄热病毒（17D）猴免疫血清中和.在传代过程中,不同代次的病毒滴度稳定在6.90LgPFU/ml以上,高峰病变出现时间为5～7 d.家兔和小鼠的免疫血清中和抗体效价分别为1：640～1：5 120和1：640～1：2 560.结论 4株Vero细胞适应株病毒生物学性状稳定,免疫原性良好.

Vero细胞致肿瘤原性的研究

目的:通过对生产疫苗所用的细胞系进行的致肿瘤原性实验,确定160代以内的Vero细胞可安全用于生产。方法:用Vero细胞和Hela细胞接种裸鼠,观察肿瘤的发生情况。结果:Vero细胞实验组裸鼠注射部位、肺部组织、肝脏组织均未见肿瘤组织发生;Hela细胞对照组的10只裸鼠全部有肿块形成,致癌致瘤率为10/10(100%)。结论:Vero细胞系非致瘤性细胞系,符合我国对疫苗生产所用细胞的要求,其在160代以内可安全用于疫苗生产。

流行性乙型脑炎疫苗基础免疫血清学效果的Meta分析

目的汇总、比较不同流行性乙型脑炎(乙脑)疫苗(Japanese Encephalitis Vaccine,JEV)基础免疫后抗体阳转率,评价血清学效果。方法电子检索《中国医院知识库》、《万方全文数据库》和西文生物医学期刊文献数据库,将研究JEV基础免疫后血清学效果的随机对照试验和非随机对照试验的文献全部纳入分析,用RevMan4.2.10软件进行统计分析。结果共纳入12篇文献,7篇有对照组。乙脑减毒活疫苗(JEV,Attenuated Live;JEV-L)、乙脑灭活疫苗(非洲绿猴肾细胞)[JEV,Inactivated(Vero Cell),JEV-I(Vero)]和乙脑灭活疫苗(原代地鼠肾细胞)[JEV-I(Primary Hamster Kidney Cell),JEV-I(PHK)]基础免疫后,抗体阳转率分别为86%[95%可信区间(ConfidenceInterval,CI):80%～91%]、83%(95%CI:72%～94%)和64%(95%CI:58%～69%)。3种疫苗基础免疫抗体阳转率两两比较,JEV-I(Vero)基础免疫后的抗体阳转率显著高于JEV-I(PHK),其他两两比较抗体阳转率的差异无统计学意义。结论JEV-L和JEV-I(Vero)基础免疫后血清学效果要高于JEV-I(PHK)。

芦荟粗多糖对体外培养人表皮细胞增殖活性及细胞周期的影响

目的研究芦荟粗多糖对体外培养人表皮细胞增殖活性及细胞周期的影响。方法在芦荟粗多糖(75、150、300、600、1200 μg／ml)的作用下,光镜观察表皮细胞形态及细胞融合时间,电镜观察细胞超微结构,MTT法以及[3H]-TdR渗入量观察细胞增殖状况,流式细胞仪检测细胞周期。结果与对照组比较,芦荟粗多糖作用后表皮细胞形态学变化不明显,但芦荟粗多糖组细胞融合时间明显缩短(P< 0．05);细胞超微结构观察发现,300、1200 μg/ml芦荟粗多糖组的细胞核内以常染色质为主,而对照组与 75μg／ml芦荟粗多糖组则以异染色质为主;从生长曲线上看,芦荟粗多糖作用2 d后细胞增殖明显增快; [3H]-TdR渗入量与对照组比较呈显著性上升(P<0．05);流式细胞分析显示,G0／G1期细胞所占百分率显著性减少,G2／M期和S期细胞所占百分率显著性增加(P<0．01)。结论芦荟粗多糖可通过影响表皮细胞的DNA合成及细胞周期来促进细胞增殖。

stx-PCR方法、Vero细胞毒性试验和酶联免疫试剂盒3种方法检测产志贺毒素大肠埃希菌的评估

目的评价stx-PCR方法、Vero细胞毒性试验和酶联免疫试剂盒3种方法在检测产志贺毒素大肠埃希菌的特异性和敏感性的差异。方法运用stx-PCR方法、Vero细胞毒性试验和酶联免疫试剂盒分别对29株大肠埃希菌参考菌株和45株食品分离大肠埃希菌株进行检测。结果 stx-PCR方法可以判定50株菌携带stx基因,同时Vero细胞毒性试验可以判定这些菌株具有细胞毒性,两者的一致性为100%;酶联免疫试剂盒能判定其中38株菌具有志贺毒素。结论 3种方法都具有很好的特异性。stx-PCR方法和Vero细胞毒性试验较酶联免疫试剂盒具有更高的敏感性,试剂盒适用于食源性疾病暴发事件中产志贺毒素大肠埃希菌的快速筛选,stxPCR方法推荐作为实验室常规快速检测方法,Vero细胞毒性试验是检测产志贺毒素大肠埃希菌是否具有志贺毒素生物学活性的金标准方法。

门脉注射异基因脾细胞诱导免疫耐受机制的研究

本实验检查了门脉注射异基因脾细胞后，受体鼠耐受的诱导及其可能的机制。结果表明，门脉注射２×１０￣７个异基因脾细胞可以诱导供体特异性混合淋巴细胞反应（ＭＬＲ）及细胞毒Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）耐受。接受异基因脾细胞门脉注射的受体鼠肝脏淋巴细胞可以非特异性地抑制ＭＬＲ，但却抑制供体特异性ＣＴＬ的产生，以ａ－Ｈ－２Ｋ￣ｂ单克隆抗体清除其中的供体细胞可以完全清除对供体特异性ＣＴＬ产生的抑制，但只能部分地（５Ｏ％左右）清除其对ＭＬＲ的非特异性抑制作用，这一结果肯定了“Ｖｅｔｏ”细胞及供体细胞中自然抑制活性在门脉耐受诱导中的作用。此外还观察到ＣＤ８￣＋脾细胞是抑制供体特异性ＣＴＬ产生的主要细胞。

遗传重配获得H5N1流感病毒Vero细胞适应株

目的以传统遗传重配技术选育HSN1流感病毒Veto细胞适应株，制备Vero细胞H5N1流感疫苗。方法以流感病毒Vero细胞适应株A／Yunnan／1／2005Va（H3N2）为母株与反向遗传学技术改造的禽流感病毒疫苗株A／Anhui／1／2005（H5N1）共同感染SPF鸡胚和Vero细胞，用羊抗A／Yunnan／1／2005Va（H3N2）抗体筛选，血抑试验和基因测序鉴定病毒型别，并进行重配株的其他相关生物学试验。结果获得了1株在Vero细胞高产的H5N1流感病毒，重配前后的单价灭活疫苗免疫小鼠抗体血清效价差异无统计学意义（F=0．857，P〉0．05）。结论通过流感病毒Vero细胞适应株与流行株的重配和抗体筛选，可以获得H5N1流感病毒Vero细胞适应株。

Vero细胞HCP试剂盒的稳定性观察

目的观察Vero细胞HCP试剂盒的稳定性。方法将Vero细胞HCP试剂盒分别于2～8℃和37℃放置不同时间,检测试剂盒的灵敏度、特异性、准确性及精密性。结果试剂盒在2～8℃放置10个月的特异性及灵敏度均较好;检测参考品的回收率在91.7%～114.8%之间;对不同制品检测结果的变异系数均小于10%。37℃放置7d,试剂盒的灵敏度仍可达12.5ng/ml;放置10d,检测参考品的回收率在85%～115%之间;对不同制品检测结果的变异系数均小于10%。结论Vero细胞HCP试剂盒于2～8℃放置10个月及37℃放置7d的稳定性较好,仍可正常使用。