牛布鲁氏菌VirB12蛋白的抗原表位生物信息学分析与原核表达

为了获得高纯度牛布鲁氏菌VirB12蛋白及其抗原表位蛋白VB-BW,试验采用生物信息学方法对牛布鲁氏菌VirB12蛋白的理化性质、空间结构、信号肽、结构域、跨膜结构、磷酸化位点、抗原表位等进行预测,在此基础上设计抗原表位蛋白VB-BW;VirB12与VB-BW基因经PCR扩增后与pGEX4T-1载体连接,并转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达蛋白;经His-Trap HP亲和纯化后对VirB12与VB-BW蛋白进行SDS-PAGE分析与Western-blot鉴定。结果表明:VirB12蛋白由172个氨基酸组成,理论等电点为10.28,脂肪族氨基酸占比较高,半衰期大于10 h;α-螺旋、β-转角、β-折叠与无规则卷曲结构占总蛋白的比例分别为38.95%、4.07%、13.95%与43.02%;含有15个氨基酸组成LIPO型信号肽与一个OmpA同源区域;无跨膜结构;有13个磷酸化位点;含有7个优势B淋巴细胞抗原表位与4个优势T淋巴细胞抗原表位;设计出的抗原表位蛋白VB-BW共有79个氨基酸,由VirB12蛋白的第67~97位与第130~172位氨基酸经刚性连接子连接组成。扩增出的VirB12与VB-BW基因大小为561 bp与270 bp;重组表达载体BL21-VB和BL21-BW在诱导剂IPTG浓度为0.2 mmol/L、诱导时间为10小时时表达出的VirB12与VB-BW蛋白含量最高,经纯化后最终获得大小为47.7 ku与36.3 ku的VirB12与VB-BW蛋白。说明试验构建出表达VirB12与VB-BW蛋白的原核表达体系。

布鲁氏菌VirB12蛋白纯化及其抗体ELISA方法的初步建立

为获得高纯度布鲁氏菌VirB12蛋白,对VirB12分泌表达蛋白先后进行亲和纯化和离子交换纯化。将其作为抗原包被ELISA板,优化反应条件后初步建立了布鲁氏菌抗体的ELISA检测方法。结果表明:蛋白纯化效果良好,重组蛋白纯度可达到98%以上。在建立的ELISA中,纯化重组蛋白的最佳包被浓度为1μg·mL-1,最适封闭剂为5%脱脂奶粉,血清最佳稀释浓度为1∶25,酶标二抗最佳工作浓度为1∶1500。对20份阳性血清及12份阴性血清的检测结果表明,其与SUANOVIR Brucella-Ab C-ELISA试剂盒的总体符合率达到90.6%,表明本试验建立的以VirB12重组蛋白为抗原的ELISA方法可以检测布氏杆菌感染抗体,有望研制成试剂盒用于养殖场布病的检测和净化。

应用VirB12蛋白建立检测牛布鲁菌血清抗体的方法

从牛布鲁菌基因组中克隆出VirB12基因,以pET-28α(+)为模板构建VirB12原核表达载体pET-V12,pET-V12在E.coli BL21(DE3)中表达重组VirB12蛋白。经Western-blotting分析,表明重组的VirB12蛋白具有免疫原性。以纯化的VirB12蛋白为抗原,建立了间接ELISA检测牛布鲁菌抗体的方法。经对300份牛血清样品间接ELISA与虎红平板试验(RBPT)检测结果的比较,该方法的敏感性为89%,特异性为98.3%,准确度为92.7%。

布鲁氏菌VirB12蛋白的生物信息学分析及功能预测

目的应用生物信息学软件和方法对布鲁氏菌VirB12基因编码蛋白的结构及功能进行预测和分析。方法从NCBI数据库中获取VirB12基因核酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列信息;使用ProtParam及ProtScale对VirB12蛋白的理化性质和亲疏水性进行分析;运用SignalP 6.0、TMHMM和NetPhos分析预测VirB12的信号肽序列、跨膜区结构及磷酸化位点;分别运用SOPMA和SWISS MODEL预测VirB12蛋白的二级结构和三级结构;运用ABCpred和SYFPEITHI预测VirB12蛋白的B细胞和T细胞抗原表位;运用STRING预测与VirB12蛋白发生相互作用的蛋白,并对其参与的生物过程进行功能富集分析;运用MEGA X对VirB12蛋白的进化关系进行分析。结果预测VirB12蛋白的相对分子质量为19.028×10~3。该蛋白由519个核苷酸编码,172个氨基酸残基构成,平均疏水系数为-0.229,为亲水蛋白。VirB12蛋白在N端有一段脂蛋白信号肽序列,其水解位点位于第15和第16个氨基酸之间,无跨膜区域,有11个磷酸化优势位点。二级结构中无规则卷曲(Cc)含量占43.02%,α螺旋(Hh)含量占38.95%,β折叠(Ee)占13.95%,β转角(Tt)占4.07%。该蛋白有15个B细胞优势抗原表位,6个限制性CTL细胞的抗原表位,有7个限制性Th细胞抗原表位。VirB12蛋白主要与VirB9、VirB10、VirB11、TolB和nuol蛋白存在相互作用,GO富集分析显示其主要参与细菌致病的生物学过程。结论生物信息学分析VirB12蛋白具有良好的抗原优势表位,参与布鲁氏菌感染宿主过程,是研究布鲁氏菌致病机制的重要靶标蛋白。