甲病毒单轮感染颗粒的构建及其应用

甲病毒(alphavirus)主要包括致关节炎的旧世界甲病毒和引发致命性脑炎的新世界甲病毒,感染人体后可引起严重疾病。为了使用安全方便的工具来研究甲病毒的入侵机制,本研究建立了基于鼠白血病病毒(murine leukemia virus,MLV)的假病毒颗粒和基于新德毕斯病毒(Sindbis virus,SINV)的病毒复制子颗粒(virus replicon particle,VRP)系统。利用包装的假病毒和复制子颗粒,验证了硫酸乙酰肝素生成相关基因B3gat3(beta-1,3-glucuronyltransferase 3)和致关节炎甲病毒入胞受体基因Mxra8(matrix remodeling associated 8)的敲除对不同甲病毒成员入胞的影响。本研究构建的MLV假病毒和SINV复制子颗粒系统,为甲病毒成员的入侵感染机制研究和抗病毒策略开发等提供了安全可靠的实验工具。

携带IFN-β基因的丙型肝炎病毒微型基因组构建及抑制病毒复制的效应

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)反应性干扰素(IFN)-β的微型基因组及其抑制效应的初步评价。方法提取poly I:C刺激的淋巴细胞总RNA,RT-PCR扩增IFN-β基因,克隆入前期构建的HCV微型基因组pT7-5U△131-315rI3Urz;PCR并鉴定插入方向,将反向插入的质粒命名为pT7-5U△131-315rIFNI3Urz。将微型基因组5U△131-315rIFNI3URz克隆入pcDNA3.1载体,获得pCMV-5U△131-315rIFNI3URz。将体外转录的5U△131-315rIFNI3URz RNA转染Huh7.5BB7细胞,48 h后检测IFN-β的表达。将pCMV-5U△131-315rIFNI3URz转染Huh7.5 JFH-1细胞系,荧光实时定量PCR法测定细胞中HCV RNA。结果成功建立了Huh7.5JFH-1细胞系;含有IFN-β的微型基因组在复制子细胞和HCV感染细胞中可以特异表达IFN-β;携带IFN-β的HCV微型基因组可以降低细胞中病毒的RNA拷贝水平,具有一定的剂量依赖效应。结论反向插入IFN-β基因的HCV微型基因组进入HCV感染细胞内表达IFN-β并靶向抑制病毒的复制,为抗HCV感染研究提供了一个新的方法和思路。

HCV细胞培养系统研究进展

我国丙型肝炎患病率高,目前临床使用干扰素┼利巴韦林治疗,但仅对50%的HCV基因1型患者有效,因此急需有效的治疗方法。由于HCV在被感染组织和血清中浓度较低,且病毒变异高,目前对HCV机制的研究仍处于初级阶段,至今尚未建立可靠、稳定的HCV动物模型及感染细胞系统。如能建立一个有效的体外复制系统,对研究HCV的附着、融合、内吞、入胞、复制、释放和发病机制等有重要意义。本文就近年来国内外出现的HCV体外感染细胞系统的研究新进展进行综述,重点对稳定性较好的HCV体外细胞培养模型和HCV假病毒感染颗粒加以阐述。

人肠道病毒复制子的研究进展

人肠道病毒(human enteroviruses,HEVs)感染人类并造成严重的健康问题。目前缺乏针对HEVs的特异性抗病毒药物,且预防HEVs感染的疫苗的种类有限。HEVs的基因组结构简单且保守,故基于病毒基因组结构的病毒复制子已成为研究HEVs的重要工具,可用于病毒的分子生物学特性、病毒与宿主的关系及抗病毒药物的筛选及疫苗的研发等方面。现就HEVs复制子的研究进展作一综述。

基于Semliki森林病毒复制子的新型RNAi质粒载体的构建

目的:以semliki森林病毒复制子为基础,构建一类可迅速高效表达shRNA的新型RNAi载体。方法:以Semliki森林病毒衍生的复制子载体pSFV1为骨架,用CMV IE启动子替换SP6启动子并在3′-UTR下游插入SV40 polyA转录终止子,在原26S亚基因组启动子后插入带有相应改良多克隆位点的shRNA表达元件,同时加入抗新霉素选择复合体,并去掉3′-UTR的重复序列。所获载体用于沉默EGFP基因,通过体外细胞转染、病毒颗粒制备、荧光显微镜观察、RT-PCR分析等初步验证、评估其效果。结果:构建了基于Semliki森林病毒复制子的新型RNAi质粒载体pSFV-RNAi Ready。经体外实验初步证实,该载体直接转染细胞,或与辅助载体共转染,制备成具有感染能力的重组病毒颗粒后使用,均可高水平表达shRNA,沉默目的基因。其中使用病毒颗粒抑抑效率可高达90%以上。结论:该载体的成功构建,可望显著拓宽SFV载体的应用范围,丰富RNAi实施手段,并用于相关科学研究及基因药物技术开发。

昆津病毒复制子——一种新型病毒载体

病毒复制子(Replicon)是指来源于病毒基因组的能够自主复制的RNA分子,保留了病毒非结构蛋白基因,而结构蛋白基因缺失或由外源基因替代。昆津病毒(Kunjun virus)为黄病毒科黄病毒属成员,其复制子具有表达效率高、细胞毒性低、遗传稳定等特点,在病毒基因组复制调控机制、外源蛋白表达、新型疫苗和基因治疗等领域得到了广泛应用。以下就昆津病毒复制子系统的构建、特性及应用方面的研究进展作一综述。