小麦Vp-1基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化

小麦成熟期穗发芽是世界性的自然灾害,严重影响小麦的产量和品质。Viviparous-1(Vp-1)是促进胚成熟和休眠的主要转录调节因子,与小麦穗发芽抗性有着密切的关系。本实验根据小麦Vp-1基因序列,以植物表达载体pAHC25为基础,成功构建了含有反向重复序列的RNA干扰表达载体pAHC-WVpRi。采用基因枪法轰击小麦品种新春9号幼胚材料1825个,共获得34株T0再生植株。利用Bar基因引物和干扰片段特异引物对再生植株进行PCR检测,获得Bar基因和干扰片段均为阳性的植株3株,转化率为0.16%。本研究为深入分析Vp-1基因功能,进而通过分子育种进行小麦穗发芽抗性的遗传改良提供了科学依据。

新疆小麦品种穗发芽Vp-1基因等位变异的分布

为了给新疆小麦抗穗发芽育种提供理论依据和品种资源,利用Vp-1基因的功能标记Vp1 B3检测了252份新疆小麦品种。结果表明,新疆小麦品种中Vp-1 Ba(感穗发芽)、Vp-1 Bb(抗穗发芽)和Vp-1 Bc(抗穗发芽)基因型的频率分别为54.8%、3.2%和42.0%,以Vp-1 Ba基因型为主。其中,冬小麦中抗、感穗发芽基因型的频率分别为39.2%和60.8%,以感穗发芽基因型为主;而春小麦中抗、感穗发芽基因型的频率分别为55.3%和44.7%,抗穗发芽基因型频率较高。农家品种、引进品种和育成品种中Vp-1 Ba、Vp-1 Bb和Vp-1 Bc基因型的分布频率存在明显差异,依次为80.4%、0.0%和19.6%,39.5%、2.6%和57.9%,54.6%、4.6%和40.8%,农家品种和育成品种都以感穗发芽基因型为主。本研究结果还表明,STS标记Vp1 B3检测方法简单、稳定性好,将其与整穗发芽法和发芽指数法结合使用,有助于提高选择效率。

穗发芽相关基因Vp-1等位变异在西部春小麦品种中的分布研究初探

青海、西藏、甘肃、宁夏、陕西位于中国的西北和西南部,属于西部地区,由于各种条件的限制,目前对于该区春小麦穗发芽状况的研究很少。本研究利用Vp-1基因的STS功能标记Vp1B3对233份来自这一地区的春小麦品种进行PCR检测,以期为西部小麦抗穗发芽育种提供理论依据和种质资源。结果表明,西部春小麦品种(系)中,Vp1B3a(感穗发芽)、Vp1B3b(抗穗发芽)、Vp1B3c(抗穗发芽)基因型频率分别为30.04%、12.02%和57.94%,以Vp1B3a和Vp1B3c基因型为主。一般红粒品种较白粒品种抗穗发芽,但在西部地区白粒品种抗穗发芽基因型频率高于红粒品种。农家品种、引进品种、育成品种中Vp1B3a、Vp1B3b和Vp1B3c的基因型频率依次为38.85%、19.42%和41.73%,26.92%、0.00%和73.08%,13.24%、1.47%和85.29%,以抗穗发芽基因型为主。由于地理气候条件的不同,Vp1基因等位变异在3省2区的分布频率也有差异,以西藏地区抗穗发芽基因型分布频率最高。

小麦WVp-1基因表达载体的Gateway技术构建及其遗传转化

为了利用中国特有的抗穗发芽小麦遗传资源,并深入分析Viviparous-1(Vp-1)基因在小麦穗发芽抗性中的作用,从抗穗发芽小麦品种西农979的干种子中分离了Vp-1基因的同源基因,命名为WVp-1。利用Gate-way技术,以植物表达载体pLeela为基础,成功构建了含有双35S启动子的高效表达载体,并转化拟南芥突变体abi3-4,获得了8株阳性植株。

基因枪介导的转Vp-1基因小麦的获得及检测

为了探究源于玉米的抗穗发芽基因Vp-1改良小麦(Triticum aestivum L.)抗穗发芽性状的可行性,以pmi及bar为筛选标记基因,通过基因枪介导法将Vp-1基因导入小麦栽培品种郑麦9023幼胚愈伤组织中,用甘露糖和双丙氨磷(Bialaphos)2种不同的筛选剂筛选得到抗性植株并对其进行PCR鉴定。结果显示,通过pmi/甘露糖筛选体系得到53株抗性植株,其中5株为转基因小麦植株,转化率为0.29%;通过bar/Bialaphos筛选体系得到152株抗性植株,其中11株为转基因小麦植株,转化率为0.78%。

3株鸡传染性贫血病毒的分离鉴定、VP1基因遗传进化分析及致病性评价

为了解国内鸡场鸡传染性贫血(CIA)的流行状况和鸡传染性贫血病毒(CIAV)的遗传变异规律,以期对CIA的传播流行和预警防控提供技术支持。本试验对2020年在3个省份疑似发生CIA的3个规模鸡场采集10份组织脏器样品,应用鸡胚进行病毒的分离培养,并对培养物进行CIAV PCR检测,进而对CIAV阳性样本进行VP 1基因扩增和测序,应用Lasergene和MEGA 6.0软件,对获得的所有分离毒株结构蛋白VP 1基因序列与GenBank中CIAV参考毒株进行比对,构建系统发育进化树,同时对分离的CIAV毒株进行动物回归试验,评价其对鸡的致病性。结果显示,10份样品中3份为CIAV阳性,共分离到3株CIAV,分别命名为202006-NX-4-2、202006-SD-2-1和202006-JX-016。VP 1基因相似性分析显示,3株CIAV分离株核苷酸相似性介于97.7%~99.6%,且均与国内分离株具有较高同源性;氨基酸序列分析显示,3株CIAV分离株毒力相关位点均与国内强毒株GD-101株一致。遗传进化分析结果显示,3株分离株属于同一进化分支(Ⅱ分支),202006-SD-2-1株和202006-JX-016株与JL15120株进化关系最近,202006-NX-4-2株则与以国内强毒株GD-101株为代表的其他Ⅱ分支参考株进化关系最近。动物回归试验结果显示,3株CIAV均能够引起1日龄鸡发生严重的淋巴器官萎缩、骨髓黄化,为典型的高致病性病毒株特征。本试验结果为当前国内CIAV的流行、毒株的遗传变异分析及相关疫苗研发提供了参考依据。

猪O型口蹄疫病毒强弱毒株VP_1基因的克隆与序列分析

本研究根据口蹄疫病毒 (FMDV)VP1基因的序列 ,设计并合成了 1对用于扩增整个VP1基因的引物 (5P、P6 )。从细胞培养液或组织中提取总RNA ,通过PT_PCR扩增 ,从F2 9株、O3I3株和T5 0 9株中均获得了 1条约 740bp的DNA电泳带。将PCR产物双酶切后电泳回收 ,插入到相应双酶切的pUC18质粒中 ,获得了重组质粒。通过PCR鉴定 ,证明重组质粒pUCVP1/F2 9、pUCVP1/O313、pUCVP1/T5 0 9均插入了VP1基因。对上述 3个重组质粒进行测序后分析 ,F2 9强毒株与O3I3、T5 0 9弱毒株相比 ,其核苷酸序列同源性分别为 98.75 %和 99.0 6 % ;因F2 9株核苷酸发生 3个碱基缺失与 1个碱基替换 ,故推导的氨基酸序列同源性分别仅为 44 .13%和 41.32 % ;而T5 0 9株与O3I3株相比 ,其核苷酸、氨基酸序列同源性分别为 99.37%和 95 .31%。通过序列分析发现 ,本研究的 3个毒株与国内大多数毒株 (包括 1997年台湾暴发FMDV所分离的毒株 ,除O/A/ 5 8株外 )均属于同一基因型 ,核苷酸序列同源性为 85 %～ 94% ;而与国外毒株相比 ,属不同的基因型 ,核苷酸序列同源性仅为 81%～ 82 %。其推导的氨基酸序列 ,除F2 9株与O/HK/ 93株及 1997年台湾暴发FMDV分离的少数毒株的氨基酸序列同源性仅为 45 %～ 6 3%外 ,本研究的

灰飞虱内生病毒HiPV外壳蛋白VP1多克隆抗体的制备及在病毒检测中的应用

【目的】前期发现水稻条纹病毒(rice stripe virus,RSV)可与介体灰飞虱Laodelphax striatellus体内的HiPV病毒(Himetobi P virus,HiPV)互作。本研究旨在制备HiPV外壳蛋白VP1的多克隆抗体,并评估其在HiPV病毒检测中的可用性,以为深入研究HiPV-RSV和HiPV-灰飞虱的互作机制提供技术支持。【方法】以RT-PCR方法从灰飞虱成虫体内扩增HiPV主要外壳蛋白基因VP 1,然后将VP 1基因亚克隆至原核表达载体pET-32a中,构建表达载体pET-VP 1。将重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG诱导、Ni 2+-NTA亲和层析纯化,获得重组蛋白,免疫新西兰大白兔,制备抗体。【结果】从灰飞虱体内克隆到774 bp的HiPV外壳蛋白基因VP 1,经原核表达、纯化,获得分子量约47.5 kD的融合蛋白,免疫新西兰大白兔后获得VP1多克隆抗体。该抗体间接ELISA效价达1∶819 200,与HiPV外壳蛋白VP1有特异性反应,而与灰飞虱蛋白无交叉反应。利用该多克隆抗体建立了检测单头灰飞虱成虫体内HiPV的Western blot和免疫捕获RT-PCR方法,检测结果显示HiPV在携带和不携带RSV的灰飞虱高亲和性群体内均广泛存在。【结论】利用制备的HiPV的VP1多克隆抗体可特异性检测灰飞虱体内HiPV。本研究为HiPV病毒的快速检测以及HiPV-RSV互作、HiPV-灰飞虱互作研究提供了技术支持。

14株北京地区犬细小病毒分离毒株的VP2、NS1基因序列分析

从北京地区疑似细小病毒感染的犬粪拭子中成功分离鉴定出14株犬细小病毒(CPV)毒株,并对其完整的VP2和NS1基因进行了序列分析。结果表明,鉴定到的14株CPV毒株中,7株为New CPV-2a型,7株为CPV-2c型。此外,NS1的19、33、293、588、624和656位氨基酸以及VP2的13、574位氨基酸为新鉴定的氨基酸突变位点。基于VP2、NS1基因的系统进化分析表明,大部分的New CPV-2a型和CPV-2c型毒株与广西南宁和吉林长春地区的分离毒株亲缘关系密切,说明本次分离毒株与广西或吉林地区分离毒株具有相同的起源。本研究为更好地开展犬细小病毒流行病学调查提供了有益借鉴,也为深入研究犬细小病毒变异和传播的分子机制奠定了基础。

鸭甲肝病毒VP1基因克隆及序列分析

通过PCR技术,从自行分离的鸭甲肝病毒JS株基因组中扩增出病毒衣壳蛋白VP1完整基因片段,并对该片段进行序列测定及分析。结果显示JS-VP1与DHAV-A的VP1基因序列酸核苷酸同源性在62.0%-64.4%之间,与DHAV-B的VP1基因序列酸核苷酸同源性在63.6%-63.8%之间,与DHAV-C的VP1基因序列酸核苷酸同源性在92.3%-98.5%之间,分析表明JS株为鸭甲肝病毒基因C型,血清型分型为韩国新型。进化树表明JS株与SD02株的亲缘关系较进,进一步说明VP1基因的核苷酸序列是DHAV基因组中的高度可变区,可作为DHAV基因型研究的标记,分离毒株为DHAV的防治及疫苗的设计奠定了基础。

小麦新品系抗穗发芽特性研究

为了筛选抗穗发芽品系,利用Vp-1基因的STS标记Vp1B3检测了来自河南省新乡市的新麦系列小麦新品系112个,并于收获期进行了室内整穗发芽试验,结果表明,112个小麦品系中Vp-1Ba(感穗发芽)、Vp-1Bb(抗穗发芽)和Vp-1Bc(抗穗发芽)基因型的频率分别为60.71%,0.89%和38.39%,以Vp-1Ba基因型为主。Vp-1Ba基因型品系穗发芽率(24.42%)极显著高于Vp-1Bc基因型品系(16.55%)。同一亲本组合选育出的品系的穗发芽率有很大差异,但Vp-1基因类型基本一致。同一Vp-1类型品系间的穗发芽率有很大差异,故在使用Vp1B3标记时需要与整穗发芽法结合使用。

青岛地区2007-2009年人肠道病毒71型的分子流行病学研究

目的了解2007-2009年青岛地区引起手足口病的人肠道病毒71（EV71）型VPI基因编码区（CDS）分子流行病学特征。方法采用荧光定量PCR对咽拭子标本进行总肠道病毒（EV）、柯萨奇病毒A16（CA16）和EV71检测。选取部分EV71检测阳性的标本进行VP1基因CDS序列的扩增及测序，对所获得的序列进行进化树分析。结果青岛市2007-2009年的51株EV71病毒核苷酸和氨基酸的差异性分别为5.3％和1．7％，所有病毒均属于C4亚型中的C4a簇。2008和2009年的基凶进化树均有多个分支产生，但每年都有一个主要分支（即优势株）。2008年的优势株与2007年山东省临沂市优势株高度同源，2008年的次优势株和2009年的优势株同与2008年安徽省阜阳市优势株高度同源。2007年的2株EV71与2007年山东省临沂市流行株高度同源。结论青岛市2008和2009年的EV71均有多个传播链存在，2008年的主传播链至2009年变为次传播链，但2008年的次传播链至2009年发展为主传播链。

手足口病患儿176例病原检测及肠道病毒71型基因特征分析

目的研究手足口病（HFMD）病原构成,对引起HFMD的肠道病毒71型（EV71）进行基因特征分析。方法采集2013年6月至8月天津市儿童医院176例临床诊断HFMD患儿的咽拭子标本,应用实时逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测标本中的肠道病毒。选取EV71阳性标本扩增基因的VP1区,测序并比对,构建进化树分析。结果 176例标本中肠道病毒总阳性率为68.8%,其中EV71为32.4%,柯萨奇病毒A组16型（CVA16）为4.0%,EV71和CVA16双阳性为1.7%,其他肠道病毒（EV）28.4%。EV71 VP1区与C4a基因型代表株核苷酸同源性为96.6%～98.9%,氨基酸同源性为98.8%～100%,亲缘进化分析显示本地区EV71与C4a基因型代表株处于同一分支。结论 EV71是2013年天津市儿童医院手足口病住院患儿主要病原,且属于C4a基因亚型。

2011年湖北省襄阳市手足口病主要病原EV71型病毒VP1基因特征分析

目的调查2011年襄阳市手足口病主要病原EV71的基因型特征,分析和探讨该型病毒的VP1基因变异和分子进化特点。方法对2011年襄阳市流行株EV71进行VP1区核苷酸序列测定和同源性比较及遗传进化分析。结果 2011年襄阳市手足口病EV71病毒的VPl区核苷酸序列全长均为891bp,与对照EV71毒株核苷酸序列同源性为96.5%～99.1%,编码蛋白氨基酸序列同源性为98.1%～100%。VP l区基因遗传进化分析显示,该中EV71病毒属于C4a基因亚型。结论 2011年襄阳市手足口病疫情主要病原EV71病毒均属于C4a基因亚型,未产生明显的抗原漂移及变异。