裂果薯总皂苷对WB-F344恶性转化细胞上皮间质转化及迁移、侵袭的影响

目的:探讨裂果薯总皂苷(SSPHs)对WB-F344恶性转化细胞上皮间质转化(EMT)及迁移、侵袭的影响及其机制。方法:采用致癌剂1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(MNNG)体外诱导大鼠肝卵圆细胞系WB-F344制备恶性转化细胞模型。实验分为对照组、MNNG组、MNNG+SSPHs组、MNNG+Wnt-1/β-catenin信号通路激活剂氯化锂(LiCl)+信号通路抑制剂(XAV-939)组、MNNG+LiCl组、MNNG+LiCl+SSPHs组。CCK-8法检测SSPHs对WB-F344恶性转化细胞活力;细胞划痕和Transwell侵袭实验分别检测WB-F344恶性转化细胞的迁移、侵袭能力;蛋白质免疫印迹(western blotting)法检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Wnt-1、β-catenin蛋白表达。结果:SSPHs处理后,WB-F344恶性转化细胞活力受到抑制(P<0.05)。与对照组比较,MNNG组划痕愈合率升高,细胞穿膜数增多,N-cadherin、Vimentin、Wnt-1、β-catenin蛋白表达上调,E-cadherin蛋白表达下调(均P<0.05)。与MNNG组比较,MNNG+SSPHs组划痕愈合率降低,穿膜数减少,N-cadherin、Vimentin、Wnt-1、β-catenin蛋白表达下调,E-cadherin蛋白表达上调(均P<0.05)。与MNNG+LiCl组比较,MNNG+LiCl+SSPHs组N-cadherin、Vimentin、Wnt-1、β-catenin蛋白表达下调,E-cadherin蛋白表达上调(均P<0.05),与MNNG+LiCl+XAV-939组结果相同。结论:SSPHs可抑制WB-F344恶性转化细胞的EMT和迁移、侵袭,其机制可能与调控Wnt-1/β-catenin信号通路相关。

过氧化氢促肝卵圆细胞株WB-F344的增殖及转化作用

目的 探讨过氧化氢（H_2O_2）对肝卵圆细胞株WB-F344的促增殖及转化作用。 方法 用H_2O_2直接作用于培养的WB-F344细胞，以MTT 比色试验、3H-TdR掺入液闪计数观察其对细胞的促增殖效应；经N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）启动的和未经MNNG启动的WB细胞用小剂量H_2O_2连续作用促其转化，以形态学观察、核型分析及甲基纤维素半固体培养进行检测。 结果 小剂量的H_2O_2一次作用具有明显的促进WB细胞增殖的效应，连续作用28 d，可促进经MNNG启动的和未经MNNG启动的WB细胞发生转化，形态上呈现典型的转化细胞的特征；核型分析显示染色体数目改变，染色体结构畸变率明显升高；在甲基纤维素半固体培养基中形成克隆。 结论 小剂量H_2O_2可诱使肝卵圆细胞增殖、转化，提示H_2O_2在肝癌发生中可能具有重要作用，抗氧化作用可能在肝癌的防治中具有一定的意义。

超氧阴离子自由基促肝卵圆细胞株WB-F344增殖、转化作用的研究

目的 探讨超氧阴离子自由基 (O- ·2 )对肝卵圆细胞株 WB- F34 4的促增殖及转化作用。方法 用黄嘌呤 -黄嘌呤氧化酶 (X- XO)系统产生的 O- ·2 直接作用于培养的 WB- F34 4细胞 ,以 MTT比色试验、3H- Tdr掺入液闪计数、3H- Tdr掺入放射自显影观察其对细胞的促增殖效应 ;细胞经 N-甲基 - N′-硝基 - N-亚硝基胍 (MNNG)启动后 ,用小剂量的 O- ·2 (10 0μmol/L X,0 .2 m U /m l XO)连续作用促其转化 ,以形态学观察、核型分析及甲基纤维素半固体培养进行检测。结果 小剂量的 O- ·2 1次作用具有明显的促进 WB细胞增殖效应 ,连续作用 15 d,促进经 MNNG启动的 WB细胞的转化 ,形态上呈现典型的转化细胞的特征 ;核型分析显示染色体数目改变 ,染色体结构畸变率明显升高 ;在甲基纤维素半固体培养基中可形成克隆。结论 小剂量的 O- ·2 可诱使肝卵圆细胞增殖、转化 ,提示 O- ·2 在肝癌的发生中具有重要作用 。

苦参碱含药血清对WB-F344细胞形态、增殖和Jagged1信号分子表达的影响

目的研究苦参碱含药血清对大鼠肝卵圆细胞系WB-F344细胞形态、增殖及Jagged1信号分子表达的影响,探讨苦参碱对肝干细胞诱导分化的作用机制。方法用不同浓度苦参碱含药血清(5%、10%、20%)作用于WB-F344细胞,以未用苦参碱含药血清处理的WB-F344细胞为空白对照组,观察细胞形态学改变,MTT法检测细胞增殖情况,免疫细胞化学法观察ALB、Jagged1蛋白表达变化,RT-PCR观察Jagged1、Hes1mRNA表达的变化。结果经苦参碱含药血清干预后,WB-F344细胞形态发生明显改变:药物组细胞较对照组细胞体积增大,核缩小,核浆比减小,培养48 h大部分细胞呈多边形。MTT结果显示,5%、10%、20%浓度的苦参碱含药血清24、48、72 h均能不同程度抑制WB-F344增殖,且存在时间、剂量依赖性。免疫细胞化学结果显示,空白对照组WB-F344细胞表达Jagged1蛋白,不表达ALB蛋白,经苦参碱含药血清处理后Jagged1蛋白表达显著下降(P<0.01),ALB蛋白表达显著升高(P<0.01)。RT-PCR结果显示,经苦参碱含药血清处理后Jagged1mRNA、Hes1mRNA表达显著下降(P<0.01)。结论苦参碱含药血清可诱导WB-F344细胞向肝细胞特性方向分化,其作用机制与调节Notch信号通路的关键分子有关。

丁酸钠体外诱导大鼠肝卵圆细胞系WB-F344细胞分化为胆管上皮细胞

目的:观察不同浓度丁酸钠对大鼠肝卵圆细胞系WB-F344细胞生长、分化的影响,探讨丁酸钠体外诱导WB-F344细胞分化为胆管上皮细胞的条件及分化规律。方法:不同浓度丁酸钠(0.75、2.25、3.75、4.5mmol/L)作用于WB-F344细胞(丁酸钠处理组),观察细胞形态学的变化,MTT法检测细胞生长情况,3.75mmol/L丁酸钠作用WB-F344细胞后,免疫组化观察细胞角蛋白19(CK19)蛋白表达的变化;RT-PCR观察CK19、β4-整合蛋白、γ-谷胺酰转肽酶(GGT)以及甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)mRNA表达的变化。以同期常规培养未作处理的WB-F344细胞作为空白对照组。结果:丁酸钠处理后,各组WB-F344细胞生长均受到抑制,3.75、4.5mmol/L丁酸钠处理组光密度值明显低于空白对照组(P<0.01),而0.75、2.25mmol/L组与空白对照组无明显差异;3.75、4.5mmol/L丁酸钠诱导后细胞变大变圆,细胞核增大,核质比减小,而0.75、2.25mmol/L组细胞形态无显著变化。3.75mmol/L丁酸钠处理组WB-F344细胞CK19阳性率为(92.3±1.1)%,明显高于空白对照组(1.3±0.2)%(P<0.01)。3.75mmol/L丁酸钠处理组可见β4-integrin表达,而空白对照组未见表达;GGT、CK19表达较空白对照组增强;空白对照组见AFP表达,而3.75mmol/L丁酸钠处理组未见表达;ALB在两组均未见表达。结论:3.75mmol/L丁酸钠适合体外诱导大鼠肝卵圆细胞系WB-F344细胞向胆管上皮细胞分化。

牛黄参含药血清对肝干细胞WB-F 344增殖和凋亡的影响

目的研究牛黄参含药血清对大鼠肝干细胞WB-F344增殖及凋亡的影响,探讨益气解毒法诱导肝干细胞的作用机制。方法采用中药血清药理学方法,以不同浓度的牛黄参含药血清(5%、10%、20%)作用于WB-F344,以正常大鼠血清(5%、10%、20%)处理的WB-F344为空白对照组,以单纯培养体系处理的WB-F344为正常对照组;四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法检测细胞的增殖,取药物血清的最佳增殖浓度,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果经牛黄参含药血清干预后,MTT检测结果显示10%、20%浓度的牛黄参含药血清均能促进WB-F344的增殖(P<0.01),且10%为增殖的最佳浓度梯度;10%牛黄参含药血清作用的WB-F344细胞凋亡率与空白、正常对照组相比显著下降(P<0.01),且以10%牛黄参含药血清成分组效果最佳。结论牛黄参含药血清可在一定程度上促进WB-F344细胞的增殖,抑制其凋亡,这可能是益气解毒法作用于肝干细胞的机制之一。

模拟微重力条件下WB-F344细胞的三维培养

与传统的单层平面培养相比,细胞三维培养可更好地模拟生物体内细胞的生长状态和微环境。以Cytodex-3微载体为支持物,利用旋转式细胞培养系统(RCCS)模拟微重力条件,悬浮培养法构建大鼠WB-F344细胞微重力三维培养模型。并通过细胞计数、光学显微镜、透射电镜、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞术等方法分析了细胞增殖、显微结构、粘附分子及钙粘蛋白(E-cadherin)表达情况。结果表明,模拟微重力三维培养条件下WB-F344细胞增殖块,呈紧密多层排列、可见丰富的微绒毛和线粒体、胞间有桥粒和紧密连接形成,细胞粘着力加强、表现出良好的三维生长特征;与静置三维培养相比,纤粘连蛋白(Fn)mRNA表达呈上调趋势,细胞内E-cadherin表达量增加,这可能是微重力效应下细胞粘附力增强的部分机制。该培养体系可能有利于细胞之间,细胞与胞外基质之间相互作用及其作用机制的研究。

活性氧对大鼠肝卵圆细胞株WB-F344钾通道的作用

用膜片箝技术的细胞贴附式 (cell-attached)观察O2.-对大鼠肝卵圆细胞株WB -F344K +通道活动的影响 ,结果发现 :1)在细胞处于静息状态时 ,在箝制电压为0mV ,每10mV阶跃 ,测试电压分别达±120mV范围内未记录到通道活动。此时 ,小剂量O2.- 也不能激活WB细胞的通道活动。在细胞外液中加入20mmol/LCaCl2 后通道开启 ,记录到小振幅的通道活动 ,它们的电导是9.48±0.93ps(n=4)。此时再用O2.-作用于细胞 ,通道被激活 ,通道电导增大 ,在正测试电压时为15.74±5.46ps(n=8) ,在负测试电压时为48.32±8.67ps(n=6)。通道活动具有外向整流特性。2)胞外加入4 -AP可抑制该通道的活动 ,而SNP则可增强通道的活动。

模拟微重力条件下对WB-F344肝干细胞表征分子表达的影响

研究大鼠WB-F344肝干细胞在旋转式细胞培养系统(RCCS)中培养进行细胞大规模扩增并保持干细胞的特性的可能性,为干细胞治疗疾病及肝组织工程提供理想的细胞来源。以WB-F344肝干细胞在RCCS中培养,以平面单层培养为对照,在培养后不同时间分别进行形态观察、流式细胞仪测细胞周期、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肝干细胞特异性基因甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)的表达,免疫荧光染色检测AFP、ALB蛋白的表达。结果表明,RCCS培养的WB-F344细胞粘附在Cytodex-3微载体上状态生长良好,细胞增殖较平面培养有明显增加;RT-PCR和免疫荧光染色检测结果一致:模拟微重力培养组AFP的mRNA表达强度及AFP阳性细胞均显著高于平面培养组,而ALB mRNA表达强度和ALB阳性细胞均低于对照组。说明模拟微重力培养条件下,能较好地维持肝干细胞特性,进一步证明这种培养体系是一种理想的肝干细胞培养模式。

三维培养条件下WB-F344细胞膜流动性及粘附分子表达变化

目的探讨三维培养条件下对WB-F344细胞膜流动性的影响和粘附分子表达的变化。方法通过荧光偏振法检测细胞膜流动性变化,并用半定量RT-PCR技术检测细胞粘附分子表达变化情况。结果与平面培养的细胞相比,三维培养的细胞膜荧光偏振度与生物膜粘度下降,说明细胞膜流动性增加。三维培养和平面培养下,各种粘附分子均可表达,而三维培养条件下纤粘连蛋白(Fn)和整合素-β1(integrin-β1)mRNA的表达明显上调,整合素-α5的表达也有所增加。结论三维培养可提高WB-F344细胞膜流动性从而维持细胞膜的功能,并上调粘附分子的表达。

益气解毒中药对肝卵圆细胞系WB-F344作用机制的研究

目的研究具有益气解毒功效的牛黄参(牛黄、西洋参)含药血清对大鼠肝卵圆细胞系WB-F344诱导分化及增殖的影响,探讨其作用机制。方法用不同浓度的牛黄参含药血清(5%、10%、20%)作用于WB-F344细胞,以正常大鼠血清(5%、10%、20%)处理的WB-F344为空白组,以单纯培养体系处理的WB-F344为正常组。四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞的增殖情况,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测WB-F344肝干细胞表面标志物甲胎蛋白(AFP)和肝白蛋白(ALB)mRNA表达情况。结果经具有益气解毒功效的牛黄参含药血清干预后,MTT结果显示,10%、20%浓度的牛黄参含药血清能促进WB-F344的增殖(P<0.01),且10%为增殖的最佳浓度梯度;RT-PCR结果显示,经10%牛黄参含药血清处理的WB-F344细胞AFP mRNA的表达随时间的延长逐渐下降(P<0.01),而ALB mRNA的表达则逐渐升高(P<0.01)。结论益气解毒中药可诱导WB-F344细胞向肝细胞特性方向的分化,可促进WB-F344细胞的增殖,这可能是其抗肝损伤、促进肝再生的机制之一。

基于iTRAQ技术的WB-F344细胞向胆管细胞分化过程中的蛋白质组学研究

目的应用iTRAQ技术观察WB-F344细胞向胆管细胞分化过程中蛋白质表达组的变化。方法将WB-F344细胞接种于丁酸钠分化体系中进行分化诱导,提取不同时间点(第0、2、4、6天)的分化蛋白以iTRAQ试剂标记后进行质谱检测并以软件分析差异表达的蛋白质。结果 iTRAQ试剂标记的WB-F344分化细胞蛋白质表达谱分析筛选出明显差异表达蛋白质点为67个,表达上调的蛋白质点33个,下调的蛋白质点34个。结论 iTRAQ技术是研究细胞分子蛋白改变的有效的蛋白质组学方法,研究将为阐明WB-F344细胞的分化机制提供可靠的实验依据。

TGF-β对WB鼠肝脏上皮细胞内Ⅰ型IP_3受体表达的影响

目的:探讨TGF-β对WB鼠肝脏上皮细胞内Ⅰ型IP3受体表达的影响。方法:通过对WB细胞的培养,应用Westernblot和RT-PCR技术分别检测在TGF-β刺激不同时间后WB细胞内Ⅰ型IP3受体蛋白和mRNA的表达。结果:TGF-β刺激不同时间后WB细胞内Ⅰ型IP3受体蛋白和mRNA的表达均有所增加,8小时的表达达到最高峰,然后开始下降。结论:TGF-β可增强WB细胞内Ⅰ型IP3受体蛋白和mRNA的表达。

超氧阴离子自由基对大鼠肝卵圆细胞胞内自由钙浓度的影响

采用激光共聚焦扫描显微镜，观察黄嘌呤／黄嘌呤氧化酶反应系统（ Ｘ／ＸＯ）生成不同浓度的超氧阴离子自由基（Ｏ２）致培养的大鼠肝卵圆细胞（ＷＢ细胞）胞质内钙浓度的变化，结果发现：仅小剂量的Ｏ２（Ｘ：２００ｍｏｌ／Ｌ ＸＯ：０．２ｍｕ／ｍＬ）引起胞质内钙浓度升高，约３０ｓ后达到峰值，６０ｓ后恢复正常。部分细胞观察到数次钙浓度间断升高、幅度逐渐下降的现象。超氧化物歧化酶（ ＳＯＤ）可抑制此变化，过氧化氢酶（ ＣＡＴ）无效果。细胞在无钙液中观察仍出现钙峰，但受内钙库耗竭剂Ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ阻断。结果表明，小剂量Ｏ２可诱使肝卵圆胞胞内钙库钙释放造成瞬间胞质自由钙浓度增高，并可能引发胞内钙浓度的衰减振荡，此可能与Ｏ２通过影响胞内重要信号转导因子钙，调控细胞生物学功能如增殖、转化相关。

双环醇拮抗DDT引起的细胞间隙连接通讯功能抑制研究

目的研究治肝炎药物双环醇对促癌剂滴滴涕(DDT)引起细胞间隙连接通讯(GJIC)功能抑制的拮抗作用及作用机制。方法划痕标记染料示踪技术直接观察DDT引起的大鼠肝上皮WB-F344细胞GJIC功能抑制并分析双环醇的作用。利用Western blot方法检测间隙连接蛋白43(Cx43)、磷酸化Cx43、E-cadherin及β-Catenin的表达和活性。细胞免疫荧光技术考察WB-F344细胞Cx43蛋白亚细胞定位、间隙连接的形成及E-cadherin和β-Catenin在细胞内的表达。结果 DDT能剂量依赖性的抑制WB-F344细胞GJIC功能,20μM浓度时小分子荧光染料Luciferyellow CH仅能从伤沿细胞向后传递1-2列细胞。双环醇能部分恢复DDT引起的GJIC功能抑制,且具有一定剂量依赖关系,其作用机制与抑制DDT引起的磷酸化Cx43蛋白表达量升高,进而恢复DDT损伤的间隙连接形成有关。DDT和双环醇对与Cx43蛋白功能密切相关的E-cadherin及β-Catenin的表达、活性及细胞内定位均无明显影响。结论双环醇能通过影响Cx43蛋白的磷酸化水平,部分恢复环境促癌剂DDT引起的WB-F344细胞间隙连接的形成,改善GJIC功能。对GJIC的功能抑制是多种促癌剂诱发肿瘤发生的重要原因,前期研究显示双环醇具预防二甲基亚硝胺/苯巴比妥诱发肝癌发生的作用,本文研究结果进一步提示,双环醇在预防杀虫剂DDT(一种主要的环境致癌物)诱发的肿瘤方面亦具有一定潜能。

过氧化氢对大鼠肝卵圆细胞内游离钙含量的影响

目的研究小剂量(800nmol/L)过氧化氢H2O2诱导培养的大鼠肝卵圆细胞(WB细胞)胞质内游离钙犤Ca2+犦i含量的变化及其机制。方法以800nmol/LH2O2刺激WB细胞,采用Fluo-3/AM作为荧光指示剂,以激光共聚焦扫描显微镜测定不同条件下犤Ca2+犦i荧光值的改变以反映犤Ca2+犦i含量的变化。结果(1)小剂量H2O2可引起犤Ca2+犦i升高,约300s后达到高峰,800s后恢复正常,过氧化氢酶(CAT)可抑制此变化;(2)细胞在无钙外环境下,相同浓度的H2O2不引起犤Ca2+犦i变化;(3)钙拮抗剂心痛定(nifedipine)不能抑制犤Ca2+犦i荧光值的升高,而蒽-9-羧酸(A9C)则可抑制此变化。结论小剂量H2O2刺激WB细胞可诱使犤Ca2+犦i含量升高,其机制可能是H2O2引起细胞膜上非选择性阳离子通道开放使胞外Ca2+进入胞内,造成胞浆内犤Ca2+犦i含量增高。

ACD全血及红细胞MAP的质量分析与保存研究

目的 充分了解 ACD全血和红细胞 MAP的质量及其保存效果 ,推广成份输血。方法 1取 ACD全血及红细胞 MAP各 2人份各分成 6小袋进行 2～ 3 0天的血糖、钾、钠、酸碱度、白细胞、红细胞、血小板与红细胞平均容积的动态观察 ;2结合质控活动 ,对 ACD全血和红细胞 MAP中的血糖、蛋白质、钾、钠、比重、白细胞、红细胞、血小板、红细胞平均容积血、血红蛋白和红细胞压积等进行随机检测与分析。结果 1红细胞 MAP中的血比重、白细胞、红细胞、血小板、红细胞压积、血红蛋白及血糖明显高于 ACD全血 ,而血浆蛋白、钠离子与酸碱度明显低 ;2血液在 2～ 3 0天的保存期间 ,白细胞、红细胞、血小板、红细胞平均容积均无改变 ;3酸碱度、钾、钠离子随保存期而明显变化 ,钾与钠离子的日变化量在红细胞 MAP比在 ACD全血中明显。结论 全血保存在 ACD或红细胞混悬于 MAP保存液中是安全与可行的 ,红细胞 MAP的内容物与 ACD全血不同 ,红细胞 MAP在失血和贫血病人中的应用值得关注并应予推广。

口腔鳞癌淋巴结转移的全身磁共振弥散加权成像的表现

目的探讨口腔鳞癌淋巴结转移在全身磁共振弥散加权成像中表现及临床意义。方法21例口腔鳞癌伴淋巴结转移的患者行WB-DWI检查,处理生成全身弥散图。其中19例另行常规MRI增强扫描,9例另用PET检查。全部病例均经病理证实。结果21例患者WB-DWI发现异常淋巴结139个,正常淋巴结11个,炎症淋巴结21个。转移淋巴结呈高信号,ADC值下降,与正常或炎症淋巴结ADC值有统计学差异。结论全身磁共振弥散加权技术在鉴别炎性或正常淋巴结与肿瘤转移性淋巴结方面能够提供准确的信息,是新一代肿瘤病人全身检查的重要方法。

140例HIV-1抗体阳性者WB带型及CD4+T细胞结果分析

目的:通过对2008年本实验室新确认140例HIV-1抗体阳性者WB带型、CD4+T细胞数的分析,了解不同人群不同病期免疫学、血清学变化特征。方法:应用免疫印迹试验(WB)、流式细胞仪检测HIV-1感染者体内抗体、CD4+T细胞数。结果:不同感染途径WB带型分布无明显差异(P>0.05),但CD4+T细胞数差异有统计学意义;年龄(age,A)≤40岁的HIV-1抗体阳性者体内全带型(9条带)与P55条带出现率分别明显高于A>40岁以上者;不同性别WB带型分布无明显差异(P>0.05),但CD4+T细胞计数之间差异有统计学意义;AIDS病人与HIV-1感染者的WB反应全带型、p55条带的出现率及CD4+T细胞数差异有统计学意义。结论:不同人群WB反应带型与CD4+T细胞数都有不同程度的差异,该项指标为追踪HIV-1传染源、传播途径及临床分期、疾病预后提供依据。

β-catenin在L2、WB、HepG2、SMCC细胞株中的异常表达及意义

目的探讨β-catenin(β-连环素)异常表达在原发性肝癌的发生、分化中的意义。方法西安航天总医院肝胆外科用免疫细胞化学检测体外培养的细胞株的β-catenin的表达,进一步研究β-catenin在原发性肝细胞癌的形成、分化中的作用。结果 WB细胞表面表达C-kit抗体,免疫细胞化学结果显示L2细胞株β-catenin几乎全部分布在细胞膜,细胞质、细胞核中几乎无表达,WB细胞株中β-catenin主要分布于细胞膜、细胞质,细胞核中有较少表达,HepG2、SMCC细胞株中β-catenin几乎全部分布于细胞质、细胞核中并有较高表达,SMCC表达多于HepG2细胞株。western blot定量显示β-catenin在L2、WB、HepG2、SMCC细胞株的细胞膜表达逐渐减少,细胞质、细胞核中的表达逐渐增多。结论β-catenin由细胞膜逐渐向细胞质、细胞核的异位表达在原发性肝癌的发生、分化过程中可能具有重要作用。