WNK2通过抑制ERK1/2/ROS/SHP2信号通路延缓肝细胞癌的增殖和侵袭

目的探讨WNK2对肝细胞癌(hepatocellocellua carcinoma,HCC)中ERK1/2/ROS/SHP2信号通路的影响,并探讨其在HCC细胞增殖和迁移中的作用。方法将WNK2-mimic和sh-RNA WNK2以及相应的阴性对照转染HepG2细胞,采用BALB/c裸鼠皮下成瘤实验检测WNK2对肝细胞癌增殖能力的影响;采用Western Blot检测瘤组织中WNK2、p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达;使用SHP2抑制剂PHPS1进行处理之后,采用Western Blot检测HepG2细胞中WNK2、p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达;使用细胞划痕实验和Transwell检测HepG2细胞的迁移能力和侵袭能力;采用单克隆增殖实验和CCK-8检测HepG2细胞的增殖能力。结果与sh-NC组相比,sh-RNA WNK2组裸鼠的瘤体体积显著增大(P<0.01);而与NC-mimic组相比,WNK2-mimic组裸鼠的瘤体体积显著减小(P<0.01);Western Blot结果显示,与sh-NC组相比,sh-RNA WNK2组WNK2的表达显著降低(P<0.01),p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达显著升高(P<0.01);而与NC-mimic组相比,WNK2-mimic组WNK2的表达显著升高(P<0.01),p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达显著降低(P<0.01);在体外实验当中,相对于sh-NC组,sh-RNA WNK2组中WNK2的表达显著降低(P<0.01),p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达显著升高(P<0.01);相对于sh-NC+PHPS1组,sh-RNA WNK2+PHPS1组中WNK2的表达显著降低(P<0.01),而p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达则被逆转并且与sh-NC+PHPS1组不具有显著性差异(P>0.05);细胞划痕实验和Transwell结果显示,相对于sh-NC组,sh-RNA WNK2组HepG2细胞的迁移和侵袭能力显著升高(P<0.01);sh-NC+PHPS1组和sh-RNA WNK2+PHPS1组HepG2细胞的迁移和侵袭能力显著降低并且不具有显著性差异(P>0.05);单克隆增殖实验结果显示,相对于sh-NC组,sh-RNA WNK2组HepG2细胞的增殖能力显著升高(P<0.01),而sh-NC+PHPS1组和sh-RNA WNK2+PHPS1组HepG2细胞的增殖能力显著降低并且不具有显著性差异(P>0.05)。结论WNK2可以抑制ERK1/2/ROS/SHP2信号通路,从而抑制ERK1/2/AKT信号通路,延缓HCC的增殖和迁移。

WNK2及MEK-1、ERK1/2在散发性结肠管状腺瘤癌变过程中的表达及意义

目的探讨WNK2、MEK-1和ERK1/2在散发性结肠管状腺瘤癌变过程中的可能作用。方法采用免疫组织化学方法检测112例散发性结肠管状腺瘤伴不同程度异型增生及癌变组织中WNK2、MEK-1和ERK1/2在蛋白水平的表达情况。结果 WNK2蛋白在正常结肠黏膜、结肠管状腺瘤伴异型增生及腺瘤癌变组中阳性表达率逐渐降低(P<0.05),分别为100%、70%和42.86%,而MEK-1及ERK1/2蛋白阳性表达率明显升高,且异型增生组和癌变组中MEK-1和ERK1/2的蛋白阳性表达率均明显高于正常结肠黏膜组(P<0.05)。WNK2蛋白的表达随结肠管状腺瘤异型增生程度的增高而降低,而MEK-1和ERK1/2的蛋白阳性表达随结肠管状腺瘤异型增生程度的增高而升高(P<0.05)。WNK2与MEK-1及与ERK1/2间存在负相关关系(r=-0.372,r=-0.371,P<0.05)。MEK-1与ERK1/2存在正相关关系(r=0.475,P<0.05)。结论 WNK2可能通过负向调节MEK-1及ERK1/2促进散发性结肠管状腺瘤的形成及癌变的发生。

基于磷酸化修饰组学分析WNK2调控卵巢癌细胞骨架形成

目的通过蛋白质磷酸化修饰组学质谱测序,分析蛋白激酶WNK2在卵巢癌细胞中调控的生物过程。方法用WNK2干扰慢病毒感染SKOV3细胞系,药筛获得稳转细胞株,提取总蛋白进行蛋白质磷酸化修饰组学质谱测序,根据生物信息学分析干扰WNK2前后SKOV3细胞中蛋白质磷酸化水平的变化,筛选磷酸化差异蛋白,KEGG及GO富集分析获取差异蛋白在卵巢癌细胞中调控的生物学过程并进行实验验证。结果通过生物信息学分析磷酸化修饰组学质谱数据,结果显示干扰WNK2后,SKOV3细胞中共有745个蛋白磷酸化水平显著下降,其中包含1078个磷酸化修饰位点发生变化,328个蛋白磷酸化水平显著上升,共415个磷酸化修饰位点发生变化。将磷酸化水平发生变化的差异蛋白进行KEGG、GO富集分析,发现WNK2主要参与了细胞骨架形成、信号传导、细胞组成、激酶活性调控等生物过程。干扰或过表达WNK2后,利用鬼笔环肽进行细胞骨架染色,结果显示,干扰WNK2后,细胞骨架断裂,排列紊乱;过表达WNK2后,细胞骨架重排增强。结论WNK2通过调控vimentin等蛋白的磷酸化水平参与卵巢癌细胞骨架形成过程。

跑台运动通过抑制WNK2表达改善糖尿病心肌病的心室重构

目的:明确运动训练延缓糖尿病诱导的心肌损伤并阐明WNK2在其中的作用。方法:雄性db/db小鼠和C57BL/6小鼠(作为对照)普通饲料喂养,根据是否参与跑台训练各分成两组,跑台组训练10周。采用心超评估小鼠心功能,留取心肌组织进行伊红苏木素(HE)染色、马松(Masson)和麦胚凝集素(WGA)染色,并提取心肌mRNA、蛋白进行实时荧光定量聚合酶链反应(RT-q PCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测。H9C2心肌细胞系予以高糖(33 mmol/L)刺激并WNK2抑制剂(WNK463)预处理后检测各组细胞肥大[肌球蛋白重链(MyHC)和心房钠尿肽(ANP)]、纤维化[包括基质金属蛋白酶9(MMP-9)、I型胶原蛋白(COL-I)和转化生长因子β(TGF-β)]指标。结果:与对照组小鼠相比,db/db组小鼠心脏明显肥厚,纤维化增加,心肌收缩能力显著下降,心脏组织WNK激酶(WNK2)表达显著增加,差异有统计学意义(P<0.05);经10周跑台运动后,心肌肥厚和胶原纤维沉积得到逆转,心收缩功能改善,并且WNK2表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。利用WNK463处理高糖刺激的心肌细胞,抑制WNK2表达,可以有效降低H9C2细胞肥大(MyHC和ANP)和纤维化(MMP9、COL-I和TGF-β)指标,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:运动训练通过抑制WNK2表达来改善糖尿病心肌病的心肌肥大及纤维化。

肾细胞癌中WNK2基因甲基化状态与mRNA表达的研究

目的探讨WNK2基因在肾细胞癌(RCC)发生及发展中的作用。方法选取2016年5月至2017年6月本院的肾肿瘤患者58例,分别应用甲基化特异性PCR(MSP)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测其RCC及相应癌旁组织、正常组织标本中WNK2基因甲基化状态和mRNA表达情况。结果在58例RCC组织、癌旁组织及正常组织中的WHK2甲基化阳性率分别为65.52%(38/58),34.48%(20/58),10.34%(6/58)。RCC组织中WNK2基因甲基化阳性率明显高于癌旁组织及正常组织。而癌旁组织及正常组织中WNK2基因甲基化发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。在RCC组织中WNK2基因启动子区甲基化的发生率在患者的不同年龄、性别、肿瘤大小、临床分期、组织学分级等临床资料间比较,差异均无统计学意义(P>0.05);WNK2 mRNA在RCC和癌旁组织、正常组织中的相对表达量分别为(0.54±0.03)、(0.66±0.02)、(0.68±0.02),RCC组织中WNK2 mRNA相对表达量明显低于癌旁组织和正常组织,差异有统计学意义(P<0.05),但癌旁组织及正常组织中WNK2 mRNA相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。在RCC组织中WNK2基因mRNA相对表达量在患者的不同年龄、性别、肿瘤大小、临床分期、组织学分级等临床资料间比较,差异均无统计学意义(P>0.05);甲基化阳性组中WNK2基因的mRNA相对表达量显著低于甲基化阴性组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论WNK2基因启动子区甲基化及其mRNA相对表达量降低可能参与了RCC的发生,但与RCC的临床进展无关。WNK2基因启动子区发生甲基化可能是引起其mRNA相对表达降低的原因之一。

微小核糖核酸-24-3p抑制肝细胞癌增殖、迁移及侵袭机制

目的探讨微小核糖核酸-24-3p(miR-24-3p)对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其机制。方法收集2019年6月至2021年8月长江大学附属荆州医院诊治的肝癌患者肝癌组织及癌旁组织。分别将miR-NC组、miR-24-3p inhibitor组、pcDNA3.1组、pcDNA3.1-WNK2组、miR-24-3p inhibitor+pcDNA3.1-NC组、miR-24-3p inhibitor+pcDNA3.1-WNK2组、miR-24-3p inhibitor+shRNA-NC组、miR-24-3p inhibitor+sh-WNK2组转染至HepG2细胞。实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-24-3p表达;蛋白质印迹法(Western blot)检测WNK赖氨酸缺陷型蛋白激酶2(WNK2)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、金属基质蛋白2(MMP-2)蛋白表达;噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖;Transwell法检测细胞侵袭、迁移情况;荧光素酶报告基因实验验证miR-24-3p与WNK2的靶向关系;体内成瘤实验检测肿瘤体积及重量。两组间均数比较采用t检验;多组间均数比较采用单因素方差分析(组间比较采用SNK检验)。结果肝癌组织miR-24-3p表达显著高于癌旁组织(1.13±0.04比2.16±0.28),WNK2蛋白表达显著低于癌旁组织(1.56±0.23比0.54±0.11),差异有统计学意义(t=14.104、15.495,P<0.05)。HepG2、Hep3B、MHCC97H及Huh7细胞中miR-24-3p表达显著高于L02细胞(分别1.68±0.20、1.26±0.13、1.31±0.21、1.43±0.24比1.01±0.10),差异有统计学意义(F=8.892,P<0.05)。miR-24-3p inhibitor组miR-24-3p表达、细胞存活率、Cyclin D1及MMP-2、迁移及侵袭数显著低于对照组及miR-NC组[0.51±0.04比1.01±0.08、(53.61±6.30)%比(97.08±9.26)%、0.49±0.14比1.26±0.22、0.71±0.10比1.35±0.35、92.47±12.18比154.01±25.30、70.10±8.08比130.10±22.30],而WNK2表达显著高于对照组及miR-NC组(1.61±0.29比0.98±0.12),差异有统计学意义(t=12.500、8.769、6.603、3.931、4.901、5.656、4.489,P<0.05)。pcDNA3.1-WNK2组WNK2表达显著高于对照组及pcDNA3.1-NC组(1.58±0.36比0.99±0.10),细胞存活率、Cyclin D1及MMP-2表达、迁移及侵袭数显著低于对照组及pcDNA3.1-NC组[(58.22±21.13)%比(101.07±13.20)%、0.62±0.20比1.29±0.23、0.71±0.26比1.37±0.25、79.40±8.45比155.31±22.35、64.89±9.02比131.62±27.23],差异有统计学意义(t=3.531、3.846、4.915、4.092、7.104、5.186,P<0.05)。pmirGLO-WNK2-wt+miR-24-3p mimics组荧光素酶活性显著低于pmirGLO-WNK2-wt+miR-NC组(0.57±0.09比0.94±0.12),差异有统计学意义(t=5.516,P<0.05)。miR-24-3p inhibitor+sh-WNK2组细胞存活率、Cyclin D1及MMP-2表达、迁移及侵袭数显著高于miR-24-3p inhibitor+shRNA-NC组与miR-24-3p inhibitor组,WNK2表达显著低于miR-24-3p inhibitor+shRNA-NC组与miR-24-3p inhibitor组,差异有统计学意义(F=17.215、28.073、4.839、19.136、53.869、6.565,P<0.05)。结论miR-24-3p可抑制肝癌增殖、迁移及侵袭,其机制可能与调控WNK2表达有关。