WSSV、IHHNV、EHP和NHPB四重荧光定量PCR检测方法的建立

本研究以对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)的VP664基因、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious Subcutaneous and Hematopoietic Necrosis Virus,IHHNV)的NSP2基因、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon Hepatopenaei,EHP)的ssr RNA基因以及坏死性肝胰腺炎细菌(Necrotizing Hepatopancreatitis Bacteria,NHPB)的16Sr RNA基因为检测对象,建立了WSSV、IHHNV、EHP和NHPB的四重荧光定量PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏性进行了研究。结果表明,建立的四重荧光定量PCR方法特异性良好,对WSSV、IHHNV、EHP和NHPB的最低检测限为4.05 copies·μL^(-1)、6.53 copies·μL^(-1)、5.85 copies·μL^(-1)和6.18 copies·μL^(-1),本实验建立的方法具有较好的应用前景。

克氏原螯虾细胞色素c基因通过调节凋亡途径抑制WSSV感染

细胞凋亡是由一系列相关基因严格调控的细胞程序性死亡,在抵御病原入侵、维持机体内环境稳态等方面有着重要意义。其中细胞色素c从线粒体释放到细胞质中是凋亡开始的关键一步。本研究利用RACE技术首次克隆获得了克氏原螯虾(Procambarus clarkii)细胞色素c基因(PcCytc),全长为897 bp,包括163 bp的5′-UTR、419 bp的3′-UTR和315 bp的开放阅读框,编码104个氨基酸。定量PCR检测结果显示,PcCytc基因在克氏原螯虾的各组织中均有表达,其中在鳃、肠道和肌肉中表达高,在胃中表达最低。WSSV感染实验显示,在病毒感染后PcCytc在肝胰腺、肠道和肌肉组织中的表达水平均出现上调,并在24 h达最高值,约是此时PBS组表达量的2.65、2.07和2.20倍,均存在极显著性差异(P<0.01)。PcCytc基因干扰后,克氏原螯虾体内WSSV病毒拷贝数显著增加(P<0.05),表明PcCytc能够抑制WSSV在克氏原螯虾体内的复制,延迟感染;同时,凋亡相关基因bcl-2、bax和caspase-3的表达均发生显著上调或下调(P<0.05)。本研究表明,PcCytc可通过调节凋亡途径抑制WSSV感染,为克氏原螯虾对WSSV感染的免疫反应提供了新的见解。

不同饵料对斑节对虾(Penaeus monodon)幼虾的生长及对WSSV敏感性的影响

采用5种不同饵料投喂斑节对虾幼虾,研究各饵料对幼虾的体长、体重及成活率的影响,实验周期为20天;然后用投喂攻毒的方法分别感染WSSV,观察不同饵料对幼虾WSSV敏感性的影响,实验周期为12天。结果表明,投喂卤虫无节幼体组的幼虾,其体长、体重增长明显优于其它各组(P<0.01),随后依次为贝肉组、鱼肉组、人工配合饲料组、虾片组。不同饵料对幼虾WSSV敏感性的影响也有差异:投喂感染WSSV后,卤虫组和鱼肉组成活率最高,明显高于贝肉组、人工配合饲料组和虾片组(P<0.01)。PCR检测表明,感染后全部幼虾个体为病毒阳性。

二温式多重PCR检测鉴别对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)的研究与应用

建立了一种同时检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)的二温式多重PCR技术。根据基因库中WSSV(AF369029)和IHHNV(NC002190)基因序列,设计了两对分别与WSSV和IHHNV某段保守基因序列互补的引物,用这两对引物对同一样品中的WSSV和IHHNV DNA模板进行多重PCR扩增,结果均同时得到了两条大小与实验设计相符的593 bp(WSSV)和356 bp(IHHNV)特异性多重PCR扩增条带,而对其他对虾疾病病原的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重PCR技术最低能检测到WSSV和IHHNV DNA各100 pg。用该多重PCR对400份临床病料进行检测,结果230份检出WSSV,阳性率57.5%;96份检出IHHNV,阳性率24%;56份同时检出WSSV和IHHNV,阳性率14%。18份为阴性,阴性率为4.5%。结果提示了WSSV和IHHNV广泛存在于中国南方的养殖对虾中,作者建立的二温式多重PCR可以用于这两种病毒的临床快速检测和鉴别诊断。

对虾WSSV人工感染螯虾及其检测

用对虾白斑综合症病毒(WSSV)人工感染淡水克氏原螯虾(Procambarusclarkii) ,感染组螯虾3～6d内全部死亡。核酸探针点杂交两次检测感染螯虾的鳃、胃、血淋巴 ,阳性检出率分别为92% (92% ) ,89 % (86 % ) ,81 % (75 % ) ,对照为11 % (3% ) ,5 % (5 % ) ,0(0) ;光镜下可观察到感染螯虾的胃、鳃组织的靶细胞核肿大、嗜酸性着染 ,电镜下病变组织细胞核可见形态大小与WSSV一致的病毒粒子 ;病毒核酸原位杂交两次检测感染螯虾的胃、鳃 ,阳性检出率均为100 % ,对照阳性检出率均为0。结果表明 :对虾WSSV可感染淡水克氏原螯虾 。

不同饵料对中国对虾幼虾生长及感染WSSV存活率的影响

采用4种饵料投喂中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)幼虾,用投喂感染的方法人工感染WSSV。测定体长、体重以及各组的攻毒存活率,实验周期15 d。ANOVA分析结果表明,投喂鲜活卤虫组体长、体重的增长明显优于其他各组,差异达极显著水平(P<0.01);投喂人工配合饵料实验组的体长、体重增长量最小;投喂鱼肉组体长增长慢于投喂蛤蜊肉组,而体重的增长快于投喂蛤蜊肉组,差异均不显著(P>0.05)。投喂卤虫成体和投喂鱼肉两组的攻毒存活率最高,明显高于投喂配合饵料和蛤蜊肉两实验组,差异达极显著水平(P<0.01);投喂卤虫组和投喂鱼肉组之间存活率无显著差异(P>0.05),投喂人工配合饵料组和蛤蜊肉组差异不显著(P>0.05)。巢式PCR检测表明,人工感染前的中国对虾幼虾少数携带WSSV,人工感染后全部个体检测到病毒特征片段。[中国水产科学,2006,13(1):52-58]

控制环境养殖下近交对中国对虾早期体重和抗WSSV性状的影响(英文)

过量的捕捞和不合理的人工育种措施,使中国对虾野生和养殖群体的遗传多样性均遭到不同程度的降低。本试验在相似的环境条件下养殖了40个野生对虾产生的家系和3个兄妹交产生的家系,定量测定了平均体重(1.43-1.58)g1 460尾中国对虾早期体重和感染白斑综合征病毒(WSSV)后存活时间的近交衰退系数。结果显示,野生对虾家系组的平均体重和平均存活时间分别为(1.58±0.01)g和(100.43±0.68)h,而兄妹交家系组平均体重和平均存活时间分别是(1.43±0.04)g和(85.84±1.70)h,平均体重和平均存活时间在两组间均存在极显著差异(P<0.01)。野生对虾家系组体重和存活时间的表型相关系数为0.16±0.00,而兄妹交家系组两者间的表型相关系数为0.20±0.00,但是两组间表型相关系数差异不显著(P>0.05)。近交系数每增加10%,体重和感染WSSV后存活时间分别衰退-3.80%±0.17%和-5.81%±0.11%,与近交能够降低生长和疾病抗性的观点相一致。实验结果表明,在选择育种和种质资源保护过程中都应该保证基础群体遗传背景最大化,从而有效控制近交。

中国明对虾抗菌肽基因应答WSSV侵染的表达及其SNP分析

通过白斑综合征病毒（wssv）感染实验，利用实时定量PCR技术研究了中国明对虾（Fenneropenaeus chinen—sis）应答病毒侵染后，已知的3种抗菌肽（对虾肽）在肝胰腺、肌肉、肠和鳃4种组织中的差异表达情况。结果显示，虽然3种抗菌肽表现出明显的组织表达特异性，即在不同组织中的表达趋势和表达丰富度存在明显的差异，但是就同一个组织而言，3种抗菌肽在1～120hWSSV侵染区间内的表达趋势基本一致，在0h（未侵染病毒）时，3种抗菌肽的表达量极低（为0）；在6～24h期间，检测到明显的表达量；48～120h期间，3种抗菌肽的表达量总体呈现下降的趋势。这暗示3种抗菌肽在对虾机体内可能具有相似的生物学功能。在此基础上，本研究对各类型中国明对虾抗菌肽的SNP位点进行了筛选，进一步对不同SNP类型与抗WSSV或易感WSSV的关联程度进行了分析，结果显示3种抗菌肽基冈的SNP位点很少，且在抗性和易感对虾群体内不存在明显的偏向分布。

WSSV感染对克氏原螯虾血细胞吞噬和肝胰腺磷酸酶活性的影响

分析了克氏原螯虾Procambarus clarkia人工感染白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)后,其血细胞吞噬(Phagocytosis)活性,肝胰腺酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)活性的变化规律,其目的是为WSSV感染与螯虾的免疫防御反应等研究提供依据。分析结果显示,随着WSSV感染克氏原螯虾时间的延长,血细胞吞噬活性、肝胰腺酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活性也随之改变,其中血细胞吞噬活性的变化规律性比较明显,可作为WSSV感染的敏感指标,也可以用作间接指示克氏原螯虾健康状况的指标。而在不同的感染时间,克氏原螯虾肝胰腺ACP与AKP的活性波动较大,无明显的规律可循,难以作为WSSV感染的敏感指标。

白斑综合征病毒(WSSV)在拟穴青蟹体内增殖的研究

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)因肉质鲜美、生长快速而成为我国主要的海水养殖经济蟹类,但是随着养殖规模的不断扩大,病害问题也越发严重。本研究通过流行病学调查和定量PCR跟踪检测的方法,研究了拟穴青蟹对白斑综合征病毒(WSSV)的易感性和WSSV在拟穴青蟹体内的增殖情况。结果表明,拟穴青蟹是WSSV的自然宿主,自然携带率为8.47%。WSSV可通过口服途径感染拟穴青蟹,并在拟穴青蟹体内快速增殖,注射感染5 d后,病毒量达到感染1d时的1.1×109倍,当病毒累积到一定量后即可致死拟穴青蟹。研究表明,拟穴青蟹是WSSV的天然宿主,在虾蟹混养过程中可以通过摄食WSSV感染虾而带毒或发病,并因此成为WSSV传播媒介,从而对虾蟹混养条件下WSSV的防治效果产生重要影响。

白斑综合征病毒(WSSV)灭活制剂对克氏原螯虾抗WSSV的研究

【目的】研究经双乙烯亚胺(BEI)灭活的白斑综合征病毒(WSSV)灭活制剂保护克氏原螯虾Procambarus clarkii抗WSSV感染的效果,以期为白斑综合征的防治提供有效的免疫方法。【方法】应用BEI对WSSV和WSSV超声破碎液进行灭活,通过口服和注射分别对克氏原螯虾进行免疫,再对其进行抗WSSV感染的效果研究。【结果】WSSV在BEI处理24 h可以被完全灭活,通过口服途径用灭活制剂免疫克氏原螯虾7 d后攻毒,克氏原螯虾死亡率显著下降,且口服免疫的效果要好于注射免疫。【结论】经BEI灭活24 h的WSSV灭活制剂对克氏原螯虾是安全的,口服免疫后可以显著降低克氏原螯虾感染白斑综合征病毒的死亡率。图2表3参19。

凡纳滨对虾抗WSSV选育家系的抗病与生长特性

从引进的无特定病原(SPF)凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)亲虾生产的子代中挑选出生长快、体格健壮等性状良好的个体作为亲本建立16个第一代选育家系,并经223d饲养和感染实验从中挑选出抗病力强、生长快的家系建立21个第二代家系.抗WSSV实验的结果表明:第一代选育各家系经感染WSSV(投喂)后的成活率在0～61.5%之间,平均成活率为30.0%±16.5%;第二代选育家系成活率在14.5%～70.0%之间,平均成活率为37.3%±15.2%,比第一代提高24.3%.21个第二代选育家系经28 d的生长实验显示:21个选育家系体长特定生长率在0.001 5～0.014 2之间,体重特定生长率在0.005 3～0.027 9之间;两代选育家系抗病与生长的结果表明:抗病较强的家系生长快,抗病差的家系生长慢,但抗病最强或生长最快的家系,其对应的生长或抗病性能则不理想.

高位池养殖过程凡纳滨对虾携带WSSV情况的动态变化

为了更好地预防对虾白斑综合征（WSS）的暴发,探讨该病毒病的流行规律,笔者针对养殖过程中对虾的携带WSSV情况展开调查。调查于2010年7月-2010年11月广东省汕尾市红海湾养殖场进行,从10口凡纳滨对虾高位养殖池中随机抽取6口进行跟踪采样。收集指标包括对虾生长状况、基本环境指标、浮游微藻种群结构和对虾病毒携带量等。本文重点报道利用实时定量PCR-TaqMan探针法检测6口精养池塘对虾体内WSSV的携带量变化情况,检测结果显示：①1-3号虾池苗种携带WSSV,其波动范围在1.3×103~1.7×104copy/g之间;②对虾在养殖过程中均带毒,鳃组织中的平均病毒携带量（2.3×109copy/g）多于肌肉组织中的平均病毒携带量（3.2×108copy/g）,且变化趋势一致,但没有显著性差异（P〉0.05）;③在整个养殖过程中对虾WSSV携带量总体呈现波动上升的趋势,期间各池出现过数次高值。前期WSSV拷贝数的波动范围在1.3×103~3.0×107copy/g之间,后期上升到1.5×106~1.2×1011copy/g,使得某些池塘养殖对虾WSS暴发。调查结果说明：1）对虾携带WSSV可以进行养殖生长;2）WSSV在对虾体内的含量是变化的,且其变化存在着一定的规律性;3）这种变化规律主要体现在带毒量随着养殖时间的进行及外界水环境中某些主要因子的变化而变化,如：养殖时间越长,带毒量越高;养殖环境中某些关键环境因子的改变,如：温差较大,不良藻相转换,天气骤变等均可引起对虾体内病毒含量较大的波动。鉴此,作者提出,构建并维持良好的浮游微藻的群落结构,注意有害藻相改变时保持养殖水体环境稳定,对环境突变前后都做好应对对虾应激的措施等可以极大程度地减少WSS暴发的可能。本研究通过对WSSV的密切跟踪,旨在更好的反映其在养殖环境下的动态变化规律,以及受各种环境因子影响的情况,从而为预防对虾WSS提供依据和参考。

铜绿微囊藻对WSSV潜伏感染对虾的致死效应

【目的】明确池塘优势蓝藻对潜伏感染白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的致死效应,为完善养殖对虾病害生态防控技术提供理论依据。【方法】分别设阳性对照组(PC)、阴性对照组(NC)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)活藻组(MAL)和铜绿微囊藻死藻组(MAD),加藻组的铜绿微囊藻初始密度均为106cells/mL,每组各设3个平行,试验周期144 h。除NC组对虾不携带WSSV外,其他组的对虾均经WSSV人工注射感染。采用实时荧光定量PCR-TaqMan探针检测对虾样品中的WSSV携带状况,并通过显微计数法统计铜绿微囊藻细胞数量。【结果】NC组对虾在试验结束时(144 h)的累计死亡率为11.1%;PC、MAL和MAD组的对虾累计死亡率随时间推移呈明显升高趋势,至试验结束时的累计死亡率分别为64.4%、82.2%和88.9%,表现为加铜绿微囊藻(MAL和MAD)组的对虾累计死亡率远高于2个对照组(PC和NC)。MAL、MAD和PC组对虾肌肉样品均携带104copies/g以上的WSSV,其中又以MAD组的WSSV携带量最高。在铜绿微囊藻试验组中,对虾死亡率与铜绿微囊藻呈显著相关(P<0.05),与WSSV的相关性则未达显著水平(P>0.05)。【结论】铜绿微囊藻能有效加速WSSV感染对虾的死亡速率,增加对虾累计死亡率,即使是死亡的微囊藻细胞也能促进对虾体内WSSV的增殖。

两株潜在益生菌安全性评价及其对凡纳滨对虾免疫力和抗WSSV能力影响

本研究以2株潜在益生菌(芽孢杆菌(Bacillus.sp)BZ5株和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)VZ5株)为研究对象。通过研究其溶血特性、常见抗生素的敏感性及感染菌体后凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的存活率,探讨了两菌株对凡纳滨对虾的安全性。注射和浸泡方式下,研究两菌株对凡纳滨虾的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化酶(POD)、抗菌酶活力变化的影响以及感染WSSV的凡纳滨对虾的存活率,探讨了两菌株对凡纳滨对虾免疫力和抗WSSV能力的影响。研究显示:芽孢杆菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株均未表现出溶血特征,且对多数常见抗生素敏感或中度敏感。在106cfu/mL浓度下,芽孢杆菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株未对凡纳滨对虾表现出明显的毒害作用。注射和浸泡方式下,芽孢杆菌组和溶藻弧菌组对虾的SOD、POD活力显著高于对照组(P<0.05),其中芽孢杆菌组对虾的SOD、POD活力显著高于溶藻弧菌组(P<0.05)。感染WSSV后,芽孢杆菌组和溶藻弧菌组对虾的半数致死时间比对照组分别延长了27.38%和21.43%(注射菌体)、24.73%和8.60%(浸泡菌体)。研究结果表明,芽孢杆菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株在提高对虾免疫力和抗WSSV能力方面具有较好的效果,在对虾养殖生产中有潜在的应用前景。

人工选育中国对虾两个群体WSSV感染相关免疫与生化因子的变化

通过分析中国对虾人工选育两个群体WSSV感染相关免疫与生化因子的变化,研究选育的两个中国对虾群体对WSSV的敏感性和抵抗力。结果表明,两个群体感染WSSV后,总细胞数(THC)在24h达到最大,随后呈下降趋势;两个群体血淋巴蛋白在感染初期和中期变化不同,但在后期均呈下降趋势;相比而言2^(#)对虾群体比6^(#)对虾群体血蛋白含量和THC下降幅度稍慢;2^(#)对虾群体和6^(#)对虾群体感染24h后酸性磷酸酶(ACP)稍有下降,随后保持较高的活性,而碱性磷酸酶(AKP)的变化除2^(#)对虾群体在感染48h有显著增大外,6^(#)对虾群体变化不明显;过氧化氢酶(CAT)、活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)与WSSV感染有密切的联系,两个群体抗氧化酶活性随WSSV增殖的变化略有不同;细胞内酚氧化酶(proPO)原变化趋势也表现出差异,斑点杂交结果显示6^(#)对虾群体比2^(#)对虾群体阳性反应较早,揭示不同群体间对WSSV感染的敏感性存在一些差异。

PCR-核酸探针斑点杂交法检测痕量白斑综合征病毒（WSSV）

设计了2对引物用于检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)，外引物用于PCR扩增，内引物用于合成探针进行斑点杂交。结果表明，外引物PCR-电泳的检出极限为1pg WSSVDNA；PCR产物经内探针斑点杂交，可检出10fg的WSSV DNA；单纯的内探针斑点杂交只能检测出1ng以上的WSSV DNA。PCR-斑点杂交的检测灵敏度比PCR-电泳高2个数量级，比单纯斑点杂交高5个数量级。Southern杂交表明，PCR-斑点杂交检测WSSV特异可靠。该方法可用于痕量WSSV的检测。

常规PCR与巢式PCR法快速检测克氏原螯虾白斑综合征病毒(WSSV)

对传统对虾白斑综合征病毒(WSSV)的PCR检测方法中的病毒模板DNA的提取方法加以改进,建立了一种快速检测克氏原螯虾(Procambarus clarkii)WSSV的PCR方法。本方法将克氏原螯虾肝胰腺组织匀浆液冻融3次进行差速离心后,在病毒沉淀中加入50μL蛋白酶K溶液,室温消化5 min,沸水中煮10 min后,10000 r/min高速离心5 min即可取上清液用于PCR扩增,结果显示:与传统的病毒模板DNA提取方法相比,本方法的PCR结果特异性强,扩增效率高,准确率高,可应用于快速大规模检测克氏原鳌虾中的WSSV。

流式细胞术检测对虾白斑症病毒(WSSV)对克氏原螯虾血细胞的感染

用WSSV粗提液人工感染克氏原螯虾,感染后分别在6,12,18,24h采血分离血细胞,通过WSSV的混合单抗和FITC标记的羊抗鼠二抗的间接免疫荧光染色,应用流式细胞仪检测病毒对克氏原螯虾血细胞的感染并分析感染强度。结果表明:分离获得的血细胞形态完好,感染后血细胞内的病毒被标记上了绿色荧光;流式检测发现,随感染时间延长,被感染细胞的百分率及平均荧光强度均逐渐升高,反映血细胞的病毒感染程度逐渐加深;PCR检测同时证实人工感染后各采样点血细胞样品均为WSSV阳性。