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Ⅰ型骨质疏松症患者长链非编码RNA WT1-AS与骨密度关系
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作者 冉仁国 张岱阳 李贺伟 《脊柱外科杂志》 2024年第3期158-163,共6页
目的探讨Ⅰ型骨质疏松症(OP)患者血清长链非编码RNA(lncRNA)WT1-AS水平与骨密度(BMD)及骨代谢指标的相关性。方法纳入2018年9月—2020年9月恩施土家族苗族自治州中心医院收治的女性Ⅰ型OP患者108例(OP组),同期绝经后骨量减少者114例(骨... 目的探讨Ⅰ型骨质疏松症(OP)患者血清长链非编码RNA(lncRNA)WT1-AS水平与骨密度(BMD)及骨代谢指标的相关性。方法纳入2018年9月—2020年9月恩施土家族苗族自治州中心医院收治的女性Ⅰ型OP患者108例(OP组),同期绝经后骨量减少者114例(骨量减少组)以及同期年龄相符的绝经后非OP女性120例(对照组)。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)测定研究对象血清lncRNA WT1-AS水平,采用酶联免疫法测定骨代谢指标,包括血清骨钙素(OCN)、β-胶原降解产物(β-CTX)和Ⅰ型原胶原N端前肽(PINP)。采用Pearson法分析OP患者血清lncRNA WT1-AS与BMD及骨代谢指标相关性,采用logistic回归法分析影响OP发生的因素;采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清lncRNA WT1-AS对OP的诊断价值。沉默大鼠前成骨细胞的lncRNA WT1-AS表达,观察lncRNA WT1-AS对前成骨细胞分化和矿化的作用。结果与对照组和骨量减少组相比,OP组OCN水平降低,β-CTX、PINP水平和lncRNA WT1-AS相对表达量升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。OP患者血清lncRNA WT1-AS水平与BMD(L_(1~4)和股骨颈)、OCN水平呈负相关(r=-0.542、-0.557、-0.608),与β-CTX、PINP水平呈正相关(r=0.576、0.595)。血清lncRNA WT1-AS水平是影响OP发生的危险因素。血清lncRNA WT1-AS水平诊断OP的ROC曲线下面积(AUC)为0.796,特异度为92.11%,灵敏度为62.96%。沉默大鼠前成骨细胞的lncRNA WT1-AS表达,可促进矿化结节生成。结论Ⅰ型OP患者血清lncRNA WT1-AS异常高表达与BMD、骨代谢有关,且影响Ⅰ型OP的发生,对OP具有一定的诊断价值。 展开更多
关键词 骨质疏松 RNA 长链非编码 wt1蛋白质
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siRNA沉默WT1对小鼠足细胞Wnt/β-catenin和nephrin表达的影响 被引量:4
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作者 周静 袁伟杰 +1 位作者 谢院生 陈香美 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期219-224,共6页
目的:研究小干扰RNA(siRNA)干扰WT1基因表达的小鼠足细胞Wnt/β-catenin信号通路的变化及其对足细胞活力和nephrin表达的影响。方法:采用RPMI-1640培养基在33℃条件下传代培养足细胞,在37℃条件下诱导足细胞分化。应用WT1基因的siRNA转... 目的:研究小干扰RNA(siRNA)干扰WT1基因表达的小鼠足细胞Wnt/β-catenin信号通路的变化及其对足细胞活力和nephrin表达的影响。方法:采用RPMI-1640培养基在33℃条件下传代培养足细胞,在37℃条件下诱导足细胞分化。应用WT1基因的siRNA转染分化成熟的小鼠足细胞,用MTT法测定细胞活力,用实时qRT-PCR和Western blotting技术分别检测mRNA和蛋白的表达。结果:RNA干扰WT1可诱导小鼠足细胞Wnt1mRNA和蛋白表达上调,p-β-catenin水平降低及足细胞活力下降,伴有足细胞nephrin mRNA和蛋白的表达明显下调。结论:沉默WT1基因的表达可诱导足细胞活力下降和nephrin表达下调,可能与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。 展开更多
关键词 wt1蛋白 足细胞 小干扰RNA Wnt/β-catenin信号通路 NEPHRIN
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NB4细胞诱导分化过程中WT1(17AA+/-)剪接变异体表达的研究 被引量:2
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作者 顾伟英 陈子兴 +4 位作者 胡绍燕 朱江 董选 沈慧玲 盛立霞 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期3-6,共4页
目的 探讨WT1(17AA+/-)剪接变异体表达的改变与NB4细胞诱导分化的关系。方法 建立了实时定量RT PCR方法检测看家基因GAPDH、WT1基因及其WT1(17AA+)剪接变异体的表达水平,以同一份标本(WT1拷贝数/GAPDH拷贝数)×104来计算WT1表达水... 目的 探讨WT1(17AA+/-)剪接变异体表达的改变与NB4细胞诱导分化的关系。方法 建立了实时定量RT PCR方法检测看家基因GAPDH、WT1基因及其WT1(17AA+)剪接变异体的表达水平,以同一份标本(WT1拷贝数/GAPDH拷贝数)×104来计算WT1表达水平,定义为WT1N(normalizedWT1expressionlevel),同样定义WT1(17AA+)N,并用流式细胞仪检测NB4细胞表面抗原CD11b的变化。结果 随着NB4细胞向粒系终末分化WT1基因及其WT1(17AA+)剪接变异体的表达水平迅速下降,全反式维甲酸(ATRA)作用0,6,12,18,24,48,72h后WT1N的平均表达水平分别为191.11, 121.17, 66.72, 43.47,18.29,4.04和3.79,WT1(17AA+) N剪接变异体的表达水平分别为105.12,46.89,20.50,10.38,8.85,2.16和1.92,两者均与CD11b的变化呈负相关(r=-0.65, P<0.01;r=-0.77,P<0.01),而且值得注意的是在ATRA作用后开始的18h内,WT1(17AA+)N /WT1N比值逐渐下降,24h后与药物作用前水平无统计学差异,表明在ATRA诱导NB4细胞分化早期以WT1(17AA+)剪接变异体表达下降为主。结论 WTl基因高表达与NB4白血病细胞分化阻滞有关,WT1(17AA+)剪接变异体可能在分化阻滞中起主要作用。 展开更多
关键词 NB4细胞 基因 肾母细胞瘤 wt1蛋白质类 细胞分化 RT-PCR
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WT1异构体比例转变对人白血病细胞株HL-60增殖和凋亡的影响 被引量:1
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作者 徐菁 覃艳红 +3 位作者 张翠明 乔爱秀 李灵敏 王宏伟 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期923-927,共5页
目的:探讨WT1异构体比例改变对人白血病细胞株HL-60增殖和凋亡的影响。方法:逆转录获得人WT1(17AA-/KTS-)异构体全长cDNA序列,连接到PCDH1-MCS1-EF1-copGFP慢病毒质粒载体上,酶切和测序证实正确构建重组质粒,建立WT1异构体表达比例改变... 目的:探讨WT1异构体比例改变对人白血病细胞株HL-60增殖和凋亡的影响。方法:逆转录获得人WT1(17AA-/KTS-)异构体全长cDNA序列,连接到PCDH1-MCS1-EF1-copGFP慢病毒质粒载体上,酶切和测序证实正确构建重组质粒,建立WT1异构体表达比例改变的单克隆细胞株。MTT法检测细胞增殖活性,形态学观察及Annexin V检测细胞凋亡。结果:成功构建了真核表达载体PCDH1-MCS1-EF1-copGFP-WT1(17AA-/KTS-),转染HL-60细胞后,实时荧光定量RT-PCR和Western blotting显示重组质粒转染细胞中WT1(17AA-/KTS-)mR-NA和蛋白水平明显高于空质粒转染组和正常对照组。重组质粒转染细胞的生长抑制率高于空质粒转染组和正常对照组,差异显著(P<0.05)。加2μmol/L三氧化二砷(As2O3)培养48 h后,形态学观察发现3组细胞都出现了凋亡形态,但重组质粒转染细胞更为明显。流式细胞术结果显示,As2O3作用24 h后,重组质粒转染细胞凋亡率较空质粒转染组和正常对照组细胞升高,差异显著(P<0.05)。结论:增加外源性WT1(17AA-/KTS-)异构体的表达能抑制HL-60细胞增殖,促进As2O3诱导的细胞凋亡。 展开更多
关键词 wt1蛋白 蛋白异构体 白血病 细胞凋亡
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WT1基因在NSCLC中的表达及其临床意义 被引量:1
5
作者 曹强 杨扬 +2 位作者 许瑞彬 刘延风 任清泉 《实用肿瘤杂志》 CAS 2019年第1期23-26,共4页
目的探讨Wilms tumor gene 1(WT1)基因在非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)中的表达及其临床意义。方法通过实时荧光定量PCR技术检测100例NSCLC组织石蜡标本及对照标本(40例癌旁组织和40例良性病变组织)中WT1基因的表达量... 目的探讨Wilms tumor gene 1(WT1)基因在非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)中的表达及其临床意义。方法通过实时荧光定量PCR技术检测100例NSCLC组织石蜡标本及对照标本(40例癌旁组织和40例良性病变组织)中WT1基因的表达量,以对照组WT1相对表达量均值为比较标准,将癌组织WT1表达量分为高表达和低表达;分析WT1表达量与NSCLC患者临床特征、生存期之间的关系。结果与对照组组织比较,WT1基因在NSCLC组织中高表达[(4. 295±1. 477) vs (1. 001±0. 002),P <0. 01]。WT1基因表达在NSCLC患者病理类型[(4. 132±0. 576) vs (6. 118±0. 525)]、分化程度[(3. 973±0. 329) vs (5. 683±0. 383)]、TNM分期[(4. 829±0. 137) vs (5. 685±0. 473)]和淋巴结转移[(3. 165±0. 499) vs (5. 186±0. 618)]方面比较,差异均具有统计学意义(均P <0. 01)。WT1高表达患者(WT1表达≥1. 001)生存期缩短(43个月vs 59个月,P=0. 002)。结论WT1基因在NSCLC组织中高表达,且高表达能够促进NSCLC分化和转移,缩短患者生存期。 展开更多
关键词 非小细胞肺/病理学 非小细胞肺/遗传学 wt1蛋白质类/代谢 wt1蛋白质类/遗传学 基因表达 逆转录聚合酶链反应/方法 预后
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白血病细胞检测WT1mRNA及其蛋白产物的价值与意义
6
作者 胡永军 滕熔 《中国血液流变学杂志》 CAS 2004年第4期448-451,454,共5页
目的 研究WT1同白血病预后的关系及其作为白血病微小残留病检测指标的可行性及实用性。方法 采用逆转录聚合酶联反应及间接免疫荧光方法检测白血病患者及正常人骨髓或外周血单个核细胞WT1mRNA及其蛋白产物。结果 WT1mRNA及其蛋白产... 目的 研究WT1同白血病预后的关系及其作为白血病微小残留病检测指标的可行性及实用性。方法 采用逆转录聚合酶联反应及间接免疫荧光方法检测白血病患者及正常人骨髓或外周血单个核细胞WT1mRNA及其蛋白产物。结果 WT1mRNA及其蛋白产物在急性白血病细胞中高表达 ,初诊急性白血病患者WT1mRNA阳性表达 (39例 )较阴性表达 (12例 )治疗完全缓解率 (38.5 % ,83.3% )低 ,急性白血病化疗完全缓解后WT1mRNA阳性表达与阴性表达无病存活率 (15 .4 % ,5 0 .0 % )经Log rank检验有统计学意义。WT1蛋白在急性白血病中的表达率为 5 1.0 % ,表达部位为细胞核 ,在白血病阴性对照组及正常对照组中的表达率为 0。结论 WT1表达同急性白血病预后呈负相关 ,其逆转录聚合酶联反应可作为监测白血病微小残留病一项实用而有价值的方法。 展开更多
关键词 wt1 急性白血病 蛋白产物 RNA 阳性表达 完全缓解 阴性 细胞核 表达率 逆转录
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WT1基因及蛋白在急性髓性白血病的表达及临床意义 被引量:1
7
作者 成枫 冯献启 +2 位作者 赵洪国 杨颉 杨堃 《山东医药》 CAS 北大核心 2010年第13期1-3,共3页
目的探讨WT1基因及其蛋白产物在急性髓性白血病(AML)的表达及临床意义。方法采用RT-PCR及免疫组化的方法检测初治及复发的AML患者、正常志愿者骨髓或外周血单个核细胞中WT1基因及其蛋白产物的表达情况,并结合临床观察WT1基因及蛋白产物... 目的探讨WT1基因及其蛋白产物在急性髓性白血病(AML)的表达及临床意义。方法采用RT-PCR及免疫组化的方法检测初治及复发的AML患者、正常志愿者骨髓或外周血单个核细胞中WT1基因及其蛋白产物的表达情况,并结合临床观察WT1基因及蛋白产物表达与疗效的关系。结果WT1基因及蛋白在45例AML初治患者中分别有39例(86.7%)和38例(84.4%)表达阳性,在6例复发患者中两者均表达阳性;AML患者WT1基因与蛋白表达呈正相关(r=0.277,P<0.05)。初治患者中WT1基因和蛋白表达阳性的初次化疗完全缓解率分别为42.4%和40.6%,表达阴性的则分别为83.3%和85.7%;WT1基因相对表达量与初治AML患者首次化疗的完全缓解率有关(2χ=4.356,P<0.05)。结论AML患者WT1基因及蛋白的表达检测可作为判断其临床预后的一种手段,WT1蛋白的表达可以作为AML免疫治疗的靶点。 展开更多
关键词 白血病 粒细胞 急性 基因 wt1 蛋白 wt1
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H-2K^b限制性WT1蛋白CTL表位肽基因疫苗的构建与鉴定 被引量:1
8
作者 范艳 杨蓉 +2 位作者 樊卫平 陈武娟 申晓贺 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期404-407,共4页
目的构建H-2Kb限制性WT1蛋白CTL表位肽的真核表达载体并检测其在293T细胞中的表达,并鉴定疫苗抗肿瘤效应。方法筛选鉴定H-2Kb限制性WT1蛋白CTL表位9肽,设计并合成肽疫苗核酸序列,插入p UC57载体,经酶切和测序鉴定,亚克隆至真核表达载体p... 目的构建H-2Kb限制性WT1蛋白CTL表位肽的真核表达载体并检测其在293T细胞中的表达,并鉴定疫苗抗肿瘤效应。方法筛选鉴定H-2Kb限制性WT1蛋白CTL表位9肽,设计并合成肽疫苗核酸序列,插入p UC57载体,经酶切和测序鉴定,亚克隆至真核表达载体pc DNA3.1(+)及p EGFP-N1载体,转染293T细胞,RT-PCR鉴定目的基因的转录,共聚焦显微镜鉴定目的基因的表达。构建pc DNA3.1(+)-WT1免疫小鼠,取小鼠脾细胞进行体外特异CTL杀伤FBL3细胞试验。结果构建的基因疫苗经测序、双酶切及PCR鉴定确认无误;其携带的目的基因可在293T细胞中表达。免疫小鼠后特异CTL对FBL3杀伤结果高于对照组(P<0.05)。结论成功构建了H-2Kb限制性WT1蛋白CTL表位肽基因疫苗,载体疫苗能在真核细胞中成功表达,疫苗特异CTL具有体外杀伤肿瘤细胞功能,为提高WT1肽疫苗的抗肿瘤效应提供了新思路。 展开更多
关键词 H-2Kb限制性 wt1蛋白 CTL 肽表位 基因疫苗
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CD2相关蛋白在足细胞分化中的作用 被引量:7
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作者 姜华军 常莹 +3 位作者 朱忠华 刘建社 邓安国 张春 《生理学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期135-142,共8页
本文旨在研究肾脏足细胞的分化特点及CD2相关蛋白(CD2-associated protein,CD2AP)在足细胞分化过程中的作用。用RPMI1640培养基在33oC许可条件下培养永生化小鼠足细胞系(未分化组),转染针对CD2AP的小分子干扰RNA(small interfering RNA,... 本文旨在研究肾脏足细胞的分化特点及CD2相关蛋白(CD2-associated protein,CD2AP)在足细胞分化过程中的作用。用RPMI1640培养基在33oC许可条件下培养永生化小鼠足细胞系(未分化组),转染针对CD2AP的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)后置于37oC非许可条件下培养(转染组),并将非许可条件下未转染组作为对照组。用MTT法检测足细胞的生长速度;用RT-PCR方法检测CD2AP、WT1、synaptopodin和nephrin mRNA表达;用Westernblot检测CD2AP、WT1和nephrin蛋白表达;用免疫荧光结合激光共聚焦方法检测CD2AP、nephrin、F-actin和tubulin在分化及未分化足细胞中的分布及其共定位情况。结果显示,CD2AP、WT1和nephrin在分化及未分化足细胞中均可稳定表达,而synaptopodin仅表达于已分化足细胞,在未分化足细胞无表达。在足细胞分化过程中,CD2AP和nephrin的表达上调(P<0.05);CD2AP、tubulin和F-actin在细胞内的分布发生改变,CD2AP与nephrin及F-actin在未分化足细胞中存在共定位关系。转染特异性siRNA下调CD2AP表达,细胞生长速度明显减慢,synaptopodin mRNA表达下调(P<0.05),细胞分化迟滞。结果表明,足细胞分化过程中伴随细胞骨架的重新分布和细胞形态的改变;CD2AP可能作为足细胞裂孔隔膜分子与细胞骨架的连接蛋白,在足细胞分化过程中发挥重要作用。 展开更多
关键词 CD2相关蛋白 足细胞 NEPHRIN SYNAPTOPODIN wt1
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维甲酸诱导HL-60细胞分化过程中WT1基因表达及其异构体比例变化的研究 被引量:3
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作者 徐菁 王宏伟 +2 位作者 杨涛 覃艳红 李晓红 《中华病理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期183-186,共4页
目的探讨全反式维甲酸(ATRA)诱导HL_60细胞分化过程中WT1基因及其异构体表达水平及比例变化。方法采用ATRA诱导HL-60细胞分化,以硝基四氮唑蓝(NBT)还原实验及细胞免疫标记CD11b检测判断细胞分化程度;即时荧光定量RT—PCR方法检测H... 目的探讨全反式维甲酸(ATRA)诱导HL_60细胞分化过程中WT1基因及其异构体表达水平及比例变化。方法采用ATRA诱导HL-60细胞分化,以硝基四氮唑蓝(NBT)还原实验及细胞免疫标记CD11b检测判断细胞分化程度;即时荧光定量RT—PCR方法检测HL-60细胞在诱导分化过程中总WT1、WT1(17AA+)及WTI(KTS+)的表达,并计算出WT1(+/+)、WT1(+/-)、WT1(一/+)、WT1(-/-)四种异构体的比例。结果ATRA诱导HI。60细胞分化过程中NBT阳性率及CD11b表达阳性率与诱导分化前(0h)相比均显著增加(P〈0.05,P〈0.001)。随着细胞分化,WT1表达水平由0h的(4.17±2.21)×10^-3降低至96h的(7.53±2.30)×10^-4;17AA+和KTS+两类异构体的比例也逐渐下降,17AA+异构体比例由0h的0.60±0.05降到96h的0.42±0.08(P〈0.05)。KTS+异构体比例由0.53±0.08降至96h的0.41±0.04(P〈0.05);四种异构体的比例变化表现不一致,WT1(+/+)比例由0h的0.32±0.06降至96h的0.17±0.03,而WT1(-/-)比例由0h的0.19±0.04升至96h的0.34±0.05,另外两类异构体比例变化差异无统计学意义。结论ATRA诱导HL60细胞分化过程中总WT1表达水平逐渐降低,分化前异构体以WT1(+/+)为主,而分化后以WT1(-/-)为主,提示WT1基因可能通过调节四种异构体比例而发挥抑制或促进分化的作用。 展开更多
关键词 维甲酸 wt1蛋白质类 细胞分化
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急性淋巴细胞性白血病患儿WT1基因与肿瘤耐药基因表达的关系 被引量:2
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作者 白晓玲 姚慧 +5 位作者 赵洪宁 郑楠 许波 孙念政 姜国胜 唐天华 《中华儿科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第10期589-592,共4页
目的 探讨儿童急性淋巴细胞性白血病 (ALL)WT1基因与肿瘤多药耐药基因 (mdr1)表达的关系 ,为临床判断预后、指导个体化治疗提供依据。方法 采用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)对 33例ALL患儿的同一份标本进行WT1mRNA及mdr1mRNA检测 ,用G... 目的 探讨儿童急性淋巴细胞性白血病 (ALL)WT1基因与肿瘤多药耐药基因 (mdr1)表达的关系 ,为临床判断预后、指导个体化治疗提供依据。方法 采用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)对 33例ALL患儿的同一份标本进行WT1mRNA及mdr1mRNA检测 ,用GQS 96 0图像处理系统软件进行半定量分析。结果  (1)初治组ALL的WT1及mdr1阳性率分别为 6 7%及 15 % ,完全缓解组分别为 2 2 %及 18% ,复发难治组分别为 92 %及 75 % ,初治组和复发难治组WT1阳性率及表达水平与完全缓解组相比 ,P均 <0 0 1,复发难治组中mdr1阳性率及表达水平与初治组和完全缓解组相比 ,P均 <0 0 1,差异均有极显著性 ;(2 )WT1与mdr1表达无明显相关关系 ,但复发难治组WT1与mdr1均阳性者多 ,占 6 7% ,均阴性的为 0 ;与初治组及完全缓解组比较差异有极显著性。结论 ALL患儿WT1基因表达的同时出现肿瘤多药耐药基因表达 ,是白血病难治及复发的重要因素 ,提示预后差。动态监测WT1及mdr1,可预测白血病难治及复发 ,指导个体化治疗 。 展开更多
关键词 儿童 基因表达 聚合酶链反应 急性淋巴细胞性白血病 wt1基因 肿瘤耐药基因
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急性髓性白血病骨髓细胞NF-κB活性及其与WT1和Bcl-2表达的关系 被引量:5
12
作者 赵谢兰 雷瑚仪 +1 位作者 高欣 陈方平 《中国医师杂志》 CAS 2006年第7期880-882,共3页
目的探讨核因子κappa B(NF-κB)的活性在急性白血病发病及疗效中的意义及其与W ilm s肿瘤基因(WT1)、B细胞淋巴瘤基因(Bc l-2)表达的关系。方法用EMSA方法检测43例急性髓性白血病病人(分初治、难治及完全缓解组)和30例对照骨髓细胞中NF... 目的探讨核因子κappa B(NF-κB)的活性在急性白血病发病及疗效中的意义及其与W ilm s肿瘤基因(WT1)、B细胞淋巴瘤基因(Bc l-2)表达的关系。方法用EMSA方法检测43例急性髓性白血病病人(分初治、难治及完全缓解组)和30例对照骨髓细胞中NF-κB的活性,用RT-PCR方法检测了各组病人骨髓细胞中WT1、Bc l-2基因的mRNA表达水平。结果急性白血病难治组NF-κB活化明显高于初治组,初治组又明显高于完全缓解组,差异有统计学意义;对照组未检测到NF-κB活化;NF-κB活性与WT1、Bc l-2的表达水平两两之间均呈正相关(r=0.909,P<0.01;r=0.494,P=0.037)。结论NF-κB的活性及WT1、Bc l-2的表达水平与急性白血病的发病及疗效有关。难治性白血病疗效差可能与NF-κB的活性及WT1、Bc l-2的表达水平增高有关。 展开更多
关键词 白血病 粒细胞 急性 骨髓细胞 NF-ΚB wt1蛋白质类 基因 BCL-2
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多重实时荧光定量PCR同时检测急性白血病患者WT1和MDR1基因表达水平方法的建立 被引量:1
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作者 徐兵 宋小燕 +4 位作者 杨柳 许文娟 黄芬 郭绪涛 周淑芸 《中华检验医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期15-19,共5页
目的 构建可同时检测AL患者WT1和MDR1基因表达水平的多重实时荧光定量PCR方法.方法 提取K562细胞的总RNA,并逆转录扩增WT1和MDR1的cDNA,通过Bam H Ⅰ及BglⅡ酶切后连接成WT1和MDR1重组片段,对WT1和MDR1重组片段进行PCR扩增,PCR产物纯化... 目的 构建可同时检测AL患者WT1和MDR1基因表达水平的多重实时荧光定量PCR方法.方法 提取K562细胞的总RNA,并逆转录扩增WT1和MDR1的cDNA,通过Bam H Ⅰ及BglⅡ酶切后连接成WT1和MDR1重组片段,对WT1和MDR1重组片段进行PCR扩增,PCR产物纯化后与pMD18载体进行连接,转化宿主菌DH-5α,构建载有WT1和MDR1基因的标准品重组质粒,用限制性核酸内切酶法和PCR法鉴定质粒.用FAM荧光标记MDR1探针、VIC荧光标记WT1探针,建立能在1个试管中同时检测WT1和MDR1基因表达水平的多重实时荧光定量PCR反应体系.应用该体系检测47例AL患者及32例对照者WT1和MDR1基因表达水平,比较两组之间WT1和MDR1基因表达水平的差异,并随访7例AL患者不同病程中WT1和MDR1基因表达水平的变化与临床预后的关系.结果 经EcoR1酶切及PCR法证实WT1和MDR1基因重组质粒已成功构建.所建立多重实时荧光定量PCR方法的灵敏度为102拷贝/μl;所建立标准曲线的R2分别为0.999和0.998.AL患者WT1和MDR1基因的表达水平中位数分别为37 000(163~6 370 000)拷贝/μg RNA和76 200(179~18 000 000)拷贝/μg RNA,显著高于对照组的258(0~643)拷贝/μg RNA和333(0~779)拷贝/μg RNA,差异有统计学意义(Z=6.755、6.736,P<0.01).对应用相同的诱导和巩固化疗方案治疗的7例AL患者进行随访,3例持续缓解患者中,WT1和MDR1的表达水平在初治时分别为2 170和86 900、1 130和5 860、1 170和586拷贝/μg RNA,治疗后WT1和MDR1的表达水平明显下降,分别为370和560、138和980、150和690拷贝/μg RNA,此3例患者获长期完全缓解.在3例完全缓解后复发患者中,WT1和MDR1表达水平在初治时分别为1 600和11800、24 800和968、48 200和1 100 000拷贝/μg RNA,在化疗获得完全缓解后均降低,但在随后治疗过程中,WT1、MDR1表达量又逐渐升高,分别为20 314和25 660、184 364和31 530、15 680和878 000拷贝/μg RNA,此3例患者最终均出现临床复发.另外1例未缓解患者初治时WT1和MDR1表达水平分别为81 600和1 200 000拷贝/μg RNA,化疗后WT1、MDR1表达水平不仅未下降,反而有所上升,分别为124 100和7 632 400拷贝/μg RNA,此例患者始终未获缓解.结论 本研究成功构建了可同时检测WT1和MDR1基因表达水平的多重实时荧光定量PCR方法.同时检测AL患者WT1和MDR1基因表达水平的变化可能有助于判断预后. 展开更多
关键词 白血病 wt1蛋白质类 P糖蛋白 聚合酶链反应
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RUNX1-RUNX1T1融合转录本及WT1转录本水平检测的室间比对研究 被引量:1
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作者 秦亚溱 朱立文 +26 位作者 林樉 耿素霞 刘生伟 程辉 邬成业 肖敏 李小青 胡瑞萍 王丽丽 刘海燕 马道新 关涛 叶远馨 牛挺 岑建农 卢利莎 孙黎 杨同华 王云贵 李涛 王玥 李庆华 赵晓甦 李玲娣 陈文敏 龙玲玉 黄晓军 《中华血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期889-894,共6页
目的通过室间比对了解国内RUNX1-RUNX1T1融合转录本及WT1转录本检测现状和真实表现。方法北京大学人民医院(简称PKUPH)制备比对样品,即用RUNX1-RUNX1T1(-)患者与RUNX1-RUNX1T1(+)患者新鲜骨髓/外周血有核细胞进行不同比例的稀释,制备出1... 目的通过室间比对了解国内RUNX1-RUNX1T1融合转录本及WT1转录本检测现状和真实表现。方法北京大学人民医院(简称PKUPH)制备比对样品,即用RUNX1-RUNX1T1(-)患者与RUNX1-RUNX1T1(+)患者新鲜骨髓/外周血有核细胞进行不同比例的稀释,制备出14种比对样本,每种样本各制备23份平行样本,加入TRIzol均质化后-70℃保存。各家中心采用RT-PCR技术同时检测各样本的RUNX1-RUNX1T1融合转录本及WT1转录本水平,统一以目的基因拷贝数/ABL拷贝数×100%的形式报告结果。通过Spearman相关分析计算各家中心与PKUPH检测结果之间的相关系数。结果①RUNX1-RUNX1T1比对:9份为阳性、5份为阴性样本,参与的20家实验室的假阳性率为5%(5/100),假阴性率为0(0/180)。每份阳性样本各家检测值均不相同,9份阳性样本各家报告的结果中位值为0.060%~176.7%,共覆盖3.5个log的范围,各份样本最高与最低报告结果的比值为5.5~12.3(去除1份明显偏离的结果)。85%(17/20)的实验室与PKUPH结果之间的相关系数≥0.98。②WT1比对:14份样本各家报告结果均不相同,中位值为0.16%~67.6%,覆盖2.6个log的范围,各样本检测最高值与最低值的比值为5.3~13.7.62%(13/21)的实验室与PKUPH结果的相关系数≥0.98。③两个转录本每家与PKUPH报告结果的相对关系不一致,2家均低于、7家均高于PKUPH,另11家为1个高于另一个低于PKUPH。结论同一样本各家中心报告的RUNX1-RUNX1T1及WT1转录本水平不同,大多数实验室与PKUPH报告的结果具有很高的一致性,实验室间不同转录本水平的相对关系不一定相同。 展开更多
关键词 融合蛋白质类 RUNX1-RUNX1T1 wt1 实时聚合酶链反应 室间比对
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WT1蛋白CTL表位肽基因载体的构建与鉴定
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作者 彭霞 樊卫平 +3 位作者 张凯 苑晓娟 刘玲玲 王亮 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2013年第4期448-451,共4页
目的构建WT1(Wilms’tumor gene 1)蛋白CTL表位肽基因载体,并检测其在293T细胞中的转录。方法设计分别含WT1-126肽、WT1-235肽以及这两种肽的基因载体,并加入Th通用表位Pan-DR-Th(PADRE),应用蛋白酶体切割软件PAProC和NetChop优化各表... 目的构建WT1(Wilms’tumor gene 1)蛋白CTL表位肽基因载体,并检测其在293T细胞中的转录。方法设计分别含WT1-126肽、WT1-235肽以及这两种肽的基因载体,并加入Th通用表位Pan-DR-Th(PADRE),应用蛋白酶体切割软件PAProC和NetChop优化各表位和间隔序列,DNA疫苗在线预测工具DyNAVacS优化真核密码子后,人工合成核苷酸序列,分别插入pUC57载体,构建pUC57-WT1质粒,测序鉴定后,酶切回收各目的片段,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒,转染293T细胞,RT-PCR检测各目的基因在293T细胞中的转录。采用无内毒素质粒大量提取试剂盒提取各重组质粒,采用紫外分光光度计测定质粒的纯度和浓度。结果各重组真核表达质粒经双酶切及测序鉴定证实构建正确;重组质粒携带的目的基因可在293T细胞中成功转录;各重组质粒DNA的纯度均合格,浓度在864.6~883.9μg/ml之间。结论成功构建了WT1蛋白CTL表位肽基因载体,并能在真核细胞中正常转录,为下一步在小鼠体内探讨特异性不同的CTLs群发挥抗肿瘤作用的机制奠定了基础。 展开更多
关键词 wt1蛋白 细胞毒性T淋巴细胞 表位肽 DNA疫苗
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WT1基因变异相关肾脏病临床、病理特点与基因变异类型的临床研究 被引量:7
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作者 孙良忠 王海燕 +8 位作者 李敏 林宏容 吴金浪 唐雯 李易娟 岳智慧 刘婷 陈华木 胡妙月 《中华儿科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第10期769-774,共6页
目的探讨WT1变异相关肾病临床、病理特点与基因变异类型的关系。方法回顾性分析2009年1月—2018年5月南方医科大学南方医院、中山大学孙逸仙纪念医院、中山大学附属第一医院儿科新诊治及既往诊治的WT1变异相关肾脏病患儿的临床和病理特... 目的探讨WT1变异相关肾病临床、病理特点与基因变异类型的关系。方法回顾性分析2009年1月—2018年5月南方医科大学南方医院、中山大学孙逸仙纪念医院、中山大学附属第一医院儿科新诊治及既往诊治的WT1变异相关肾脏病患儿的临床和病理特点,与WT1基因变异的相关性。结果共诊治WT1变异相关肾脏病患儿20例(新诊治5例),男6例,女14例。(1)Denys-Drash综合征10例:发现蛋白尿的中位年龄为1岁7月龄。弥漫系膜硬化3例,微小病变4例,局灶节段肾小球硬化(FSGS)1例,2例无病理。2例见肾小球基底膜(GBM)显著弥漫增厚。钙神经素抑制剂(CNIs)治疗5例,3例完全缓解,2例部分缓解。8例肾功能仍正常。基因检查结果WT1错义变异6例,无义变异3例,移码变异1例。(2)Frasier综合征(FS)2例:发现蛋白尿的年龄分别为1岁1月龄和1岁9月龄;均为FSGS,GBM分层。分别在1岁6月龄和6岁6月龄进入终末期肾脏病(ESRD)。CNIs治疗1例,蛋白尿部分缓解。均为WT1基因剪切变异。(3)孤立性肾病8例:3例为剪切变异,其中1例5月龄发病已进入ESRD,FSGS 1例,微小病变1例,均见GBM分层;CNIs治疗,1例部分缓解,肾功能正常,1例无效,6岁9月龄进入ESRD。5例为错义变异;3例病理为弥漫系膜硬化的患儿,2例在6月龄即进入ESRD,1例9岁进入ESRD。结论Denys-Drash综合征病情进展慢。WT1基因变异相关肾病基因变异类型中错义变异为11/20,剪切变异为5/20,其中剪切变异相关肾病起病早、进展快,可见GBM分层。CNIs治疗有效降低尿蛋白(8/9)。 展开更多
关键词 WTl蛋白质类 肾疾病 基因 肾小球基底膜
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儿童肾母细胞瘤WT1基因突变四例报道 被引量:1
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作者 蒋也平 沈颖 +1 位作者 孙宁 王辉 《中华儿科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期762-766,共5页
目的研究儿童肾母细胞瘤患者WT1基因的突变类型及突变频率。方法应用聚合酶链反应(PCR)扩增出54例儿童肾母细胞瘤患者WT1基因全部10个外显子及其相邻内含子序列,经纯化后进行PCR产物直接测序。结果4例患者WT1基因分别存在3个杂合无... 目的研究儿童肾母细胞瘤患者WT1基因的突变类型及突变频率。方法应用聚合酶链反应(PCR)扩增出54例儿童肾母细胞瘤患者WT1基因全部10个外显子及其相邻内含子序列,经纯化后进行PCR产物直接测序。结果4例患者WT1基因分别存在3个杂合无义突变及1个纯合错义突变。例1患者WT1基因7号外显子第1006位碱基A—T杂合突变,造成第336号氨基酸由赖氨酸转变为终止密码子,即K336X。例2患者WT1基因9号外显子第1168位碱基C—T杂合突变,造成第390号氨基酸由精氨酸转变为终止密码子,即R390X。例3患者WT1基因6号外显子第814位碱基G—T杂合突变,造成第272号氨基酸由谷氨酸转变为终止密码子,即E272X。例4患者WT1基因10号外显子第1228位碱基A—G纯合突变,造成第410号氨基酸由丝氨酸转变为甘氨酸,即S410G。结论散发的中国儿童。肾母细胞瘤患者册1基因外显子突变的发生率与国外报道相近,检测到的4例突变患者中3例为无义突变、1例为错义突变。 展开更多
关键词 基因 肾母细胞瘤 wt1蛋白质类 突变
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宫内生长迟缓引起大鼠肾单位数目减少的机制研究 被引量:4
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作者 陈径 徐虹 +2 位作者 郭维 沈茜 朱列伟 《中华肾脏病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期318-322,共5页
目的 探讨宫内生长迟缓(IUGR)引起肾单位数目减少的机制。方法 采用孕期全程低蛋白(6%蛋白)营养建立IUGR大鼠模型。选取IUGR新生雄鼠作为研究对象,采用Ki-67免疫染色和TUNEL法检测肾组织细胞的增殖和凋亡;实时定量PCR测定肾组织WT1... 目的 探讨宫内生长迟缓(IUGR)引起肾单位数目减少的机制。方法 采用孕期全程低蛋白(6%蛋白)营养建立IUGR大鼠模型。选取IUGR新生雄鼠作为研究对象,采用Ki-67免疫染色和TUNEL法检测肾组织细胞的增殖和凋亡;实时定量PCR测定肾组织WT1、Bcl-2、Bax及p53的mRNA表达水平;免疫组织化学法及Western印迹法检测肾组织中WT1和Bcl-2蛋白质表达。2周龄时测定肾单位数目。结果 2周龄时,IGUR大鼠肾单位数目明显少于对照组(P<0.01)。与对照组相比,IUGR新生鼠生肾区TUNEL阳性细胞数明显增多;肾脏WT1、Bcl-2 mRNA表达减少,Bcl-2 mRNA/Bax mRNA的比例降低.而p53 mRNA的表达差异无统计学意义;肾组织中WT1和Bcl-2蛋白质的表达量及在生肾区的分布也明显减少。结论 IUGR大鼠肾单位数目减少可能与肾发生中细胞凋亡增加相关,而WT1、Bcl-2表达减少,Bcl-2/Bax比例降低可能是细胞凋亡增加的分子机制之一。 展开更多
关键词 生长障碍 肾单位 凋亡 wt1蛋白质类 基因 BCL-2
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Denys-Drash综合征三例临床病理特点 被引量:2
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作者 王海燕 孙良忠 +3 位作者 岳智慧 杨娟 蒋小云 莫樱 《中华儿科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期855-858,共4页
目的探讨Denys—Drash综合征(DDS)的临床病理特征,以加深对DDS的认识。方法总结2009至2011年诊治3例DDS患儿的临床病理特点和WT1检测结果,并结合文献复习。结果3例DDS,例1、例2为核型46XX、外生殖器正常女性,例3为男性伴双侧腹股... 目的探讨Denys—Drash综合征(DDS)的临床病理特征,以加深对DDS的认识。方法总结2009至2011年诊治3例DDS患儿的临床病理特点和WT1检测结果,并结合文献复习。结果3例DDS,例1、例2为核型46XX、外生殖器正常女性,例3为男性伴双侧腹股沟隐睾。肾病起病年龄分别为1岁9个月、2岁4个月及3个月。例2、例3激素治疗无效。例1使用他克莫司,血浆白蛋白、胆固醇有改善,尿蛋白无缓解。例2用环孢素A、他克莫司蛋白尿均能缓解;现4岁9个月,蛋白尿缓解,肾功能正常。3例均是右肾单侧Wilms瘤,残肾病理均为弥漫系膜硬化。WT1检测:例1为外显子9的c.1213C〉G错义突变,为新突变;例2、例3分别为e.1168C〉T无义突变和c.1130A〉T错义突变。结论DDS肾病临床表现变化较大,起病多较早,肾衰竭常在4岁以前出现,少数起病及肾衰竭出现较晚。其蛋白尿对激素治疗无效,但对钙神经素抑制剂环孢素A有效;本研究2例患儿使用他克莫司亦有效。DDS多因WT1突变所致,肾脏病理主要为弥漫系膜硬化。 展开更多
关键词 Denys-Drash综合征 病理学 临床 wt1蛋白质类 弥漫系膜硬化
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Influence of Bushenhuoxue on podocytes of focal segmental glomerulosclerosis mice 被引量:1
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作者 Chunxia Zuo Xiaoyue Tan +2 位作者 Shengqin Jia Mianzhi Zhang Daning Zhang 《Journal of Traditional Chinese Medicine》 SCIE CAS CSCD 2014年第5期591-596,共6页
OBJECTIVE: To observe the effects and mechanisms of Bushenhuoxue on desmin and nephrin expression in mice podocytes, and to investigate its effects on wt1 expression in Wilms' tumor.METHODS: Adriamycin(ADR) was us... OBJECTIVE: To observe the effects and mechanisms of Bushenhuoxue on desmin and nephrin expression in mice podocytes, and to investigate its effects on wt1 expression in Wilms' tumor.METHODS: Adriamycin(ADR) was used to induce focal segmental glomerulous sclerosis(FSGS) in mice. Bushenhuoxue was used to treat FSGS for 6 weeks. We measured body mass and right renal mass, and determined serum albumin(ALB) levels,protein content in urine, and urinary protein and albumin creatinine ratio(UACR). Changes in renal tissue morphology were evaluated by microscopy.wt1 and nephrin expression in podocytes were detected using immunofluorescence. Expression levels of desmin, wt1 and nephrin m RNAs in renal tissue were determined using reverse transcription polymerase chain reaction assays.RESULTS: Protein levels in urine and UACR were significantly increased in FSGS model mice compared with Bushenhuoxue-treated and control mice.Body mass and ALB levels were decreased in FSGS mice compared with control and Bushenhuoxue-treated mice. Expression of the wt1 protein was observed in control mice. Compared with controls,wt1 expression levels were reduced in Bushenhuoxue-treated mice, and to a greater extent in FSGS mice. Nephrin protein expression was widespread in FSGS mice, and significantly reduced in control and Bushenhuoxue mice. Expression levels of wt1 and nephrin m RNAs in FSGS mice were lower compared with those in control and Bushenhuoxue-treated mice. Desmin m RNA levels in FSGS mice were reduced compared with those in control and Bushenhuoxue-treated mice.CONCLUSION: Bushenhuoxue ameliorated albuminuria in FSGS mice; this was possibly related to the up-regulation of wt1 and nephrin, and down-regulation of desmin. 展开更多
关键词 DOXORUBICIN Glomerulosclerosis focalsegmental PODOCYTES wt1 proteins NEPHRIN Des-min Bushenhuoxue
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