温阳化浊通络方体外抑制HIF-1a/Foxm1/smad3信号通路改善系统性硬化病肺微血管损伤

目的利用系统性硬化病(systemic sclerosis,SSc)肺微血管内皮细胞缺氧模型,研究温阳化浊通络方抑制内皮细胞的内皮-间充质转化(EndoMT)改善肺微血管损伤的分子机制。方法利用SSc患者血清培养正常人肺微血管内皮细胞构建SSc肺微血管内皮细胞,液体石蜡封闭法建立SSc肺微血管内皮细胞缺氧模型,并分别用温阳化浊通络方含药血清或HIF-1a抑制剂KC7F2处理,Western blot检测VE-cadherin、CD31、vimentin、HIF-1α、Foxm1、smad3、Tie-1以及vWF的蛋白表达水平,ELISA检测细胞培养液中的E-selectin和ICAM-1的浓度,双荧光素酶报告基因系统检测Foxm1基因启动子活性。结果与对照组相比较,模型组细胞中的VE-cadherin、CD31、HIF-1a、Foxm1、smad3、Tie-1和vWF蛋白表达水平显著降低,vimentin蛋白表达水平以及细胞培养液中E-selectin和ICAM-1的浓度显著增高,同时细胞形态呈现出明显的“纺锤体样”成肌纤维细胞形态,而温阳化浊通络方和KC7F2能够逆转这些缺氧诱导的蛋白表达水平,以及细胞形态的改变。结论温阳化浊通络方能够改善SSc肺微血管损伤,其作用机制可能是抑制HIF-1a/Foxm1/smad3通路介导的肺微血管内皮细胞EndoMT。

温阳化浊通络方对系统性硬化病小鼠Sema3A/Nrp1信号通路的影响

目的研究温阳化浊通络方(WYHZTLF)对系统性硬化病(systemic sclerosis,SSc)小鼠信号素3A(semaphorin 3A,Sema3A)/神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1,Nrp1)信号通路的影响,探讨其治疗SSc的作用机制。方法构建SSc小鼠模型,分为对照组、模型组、温阳化浊通络方低(21 g·kg^(-1))、中(42 g·kg^(-1))、高(84 g·kg^(-1))剂量组和Sema3A抑制剂表没食子儿茶素没食子酸酯组(epigallocatechol gallate,EGCG),连续灌胃给药4周,对照组和模型组给予生理盐水处理。HE染色观察皮肤病理损伤及真皮厚度;免疫组织化学法检测皮肤组织血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)表达水平;Western blot检测皮肤组织Sema3A、Nrp1及VEGFA的表达水平;ELISA法检测小鼠血清Sema3A表达水平。结果与模型组相比,温阳化浊通络方明显缓解了SSc小鼠的皮肤病变,对真皮厚度有明显的抑制作用,降低了皮肤组织VEGFA的蛋白表达水平,同时抑制了皮肤组织及血清中Sema3A/Nrp1信号通路的蛋白表达水平。结论温阳化浊通络方可能通过抑制Sema3A/Nrp1信号通路蛋白表达水平,降低VEGFA的表达,改善SSc血管损伤。

温阳化浊通络方治疗系统性硬化病的研究进展

本课题组创造性地提出“肺脾肾-皮毛”相关理论来阐释系统性硬化病的发病机制,并根据此理论研制了温阳化浊通络方治疗系统性硬化病,取得了良好的治疗效果。在此基础上,我们通过一系列研究阐释了温阳化浊通络方治疗系统性硬化病的作用机制。本文从理论基础、临床研究、药效物质基础研究、作用机制研究等方面对温阳化浊通络方治疗系统性硬化病的研究进展作详细总结。

温阳化浊通络方含药血清抑制硬皮病患者Th17细胞增殖的作用机制研究

目的研究温阳化浊通络方含药血清对维甲酸相关孤核受体(RORγt)表达及甲基化的影响,探讨其调控辅助性T细胞17(Th17)增殖从而治疗硬皮病的作用机制。方法分别灌胃Wistar大鼠15、30、60 g/(kg·d)温阳化浊通络方药液后制备不同剂量的含药血清,同时收集硬皮病患者外周血分选Th17细胞。以空白血清作为空白对照,甲基化转移酶抑制剂地西他滨(DCA)作为阳性对照,用不同剂量含药血清处理Th17细胞后,采用CCK-8法检测Th17细胞的增殖,采用qRT-PCR法检测细胞中RORγt、白细胞介素17(IL-17)mRNA的表达,采用Western blot法检测细胞中RORγt蛋白表达,采用酶联免疫吸附测定法检测细胞上清液中IL-17蛋白表达,采用甲基化特异性PCR法检测细胞中RORγt基因启动子甲基化水平,并采用双荧光素酶法检测细胞中RORγt基因启动子的转录活性。结果与空白对照比较,各剂量温阳化浊通络方含药血清和DCA均可抑制Th17细胞的增殖(P<0.05),降低RORγt、IL-17 mRNA及其蛋白的表达水平,提高RORγt基因启动子甲基化水平,减弱RORγt基因启动子转录活性;其中除含药血清低剂量组Th17 mRNA表达水平和RORγt基因启动子甲基化水平外,其余各组上述指标差异均有统计学意义(P<0.05)。结论温阳化浊通络方可通过促进RORγt基因甲基化,抑制RORγt表达及IL-17分泌,进而抑制Th17细胞的增殖。

温阳化浊通络方抑制系统性硬化病EndoMT的机制研究

目的:研究温阳化浊通络方抑制系统性硬化病(Systemic sclerosis,SSc)肺血管内皮细胞内皮-间充质转化(Endothelium-mesenchymal transformation,EndoMT)的效应和潜在分子机制。方法:利用博来霉素构建SSc小鼠模型,然后分别利用温阳化浊通络方或HIF-1α抑制剂KC7F2处理。采用masson染色观察小鼠肺组织纤维化程度。采用免疫组化检测小鼠肺组织和细胞中HIF-1α、Foxm1、smad3、VE-Cadherin、vimentin的蛋白表达水平。结果:在SSc小鼠模型中,温阳化浊通络方和KC7F2能够显著抑制小鼠肺组织的纤维化,并且下调肺组织中HIF-1α、Foxm1、smad3、vimentin的蛋白表达水平(P<0.05),同时上调VE-cadherin的蛋白表达水平(P<0.05)。结论:温阳化浊通络方能够抑制SSc肺血管内皮细胞EndoMT,其分子机制与其抑制HIF-1α/Foxm1/Smad3信号通路有关。

温阳化浊通络方对系统性硬化症模型小鼠TGF-β1/Smad信号通路的影响

目的探讨温阳化浊通络方治疗系统性硬化症(SSc)的可能作用机制。方法将60只C3H/He小鼠随机分为正常组、模型组、西药组和中药低、中、高剂量组,每组10只。除正常组外其余各组给予皮下注射博莱霉素3周建立SSc小鼠模型。西药组小鼠灌服青霉胺片65 mg/(kg·d),中药低、中、高剂量组分别灌服温阳化浊通络方水煎剂11.75、23.50、47.00 g/(kg·d),模型组和正常组给予等体积的生理盐水,共干预8周。采用HE染色观察皮肤组织病理变化,采用RT-PCR法检测皮肤转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad2、Smad7 mRNA表达,采用Western blot法检测皮肤Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白(COL-Ⅰ、COL-Ⅲ)表达。结果模型组较正常组皮肤真皮变厚,胶原增加、变粗,真皮小血管周围炎症细胞浸润,西药组和中药低、中、高各剂量组与模型组比较真皮变薄、胶原含量减少,血管周围炎症细胞浸润减轻。与正常组比较,模型组TGF-β1、Smad2 mRNA及COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白表达升高,Smad7 mRNA表达降低(P<0.01);与模型组比较,西药组和中药低、中、高剂量组TGF-β1、Smad2 mRNA及COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白表达减少,Smad7 mRNA表达增加(P<0.05或P<0.01);中药高剂量组TGF-β1、Smad2、Smad7 mRNA及COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白表达改善优于西药组和中药低剂量组(P<0.05或P<0.01)。结论温阳化浊通络方可拮抗SSc纤维化,可能与干预TGF-β1/Smad信号通路、降低皮肤胶原蛋白含量有关,且高剂量效果更佳。

从肺脾肾-皮毛相关论治系统性硬化病的理论基础

文章分析了肺脾肾-皮毛相关理论的内涵,从中医病机学角度探讨肺脾肾-皮毛相关与系统性硬化病(SSc)的联系,认为肺脾肾阳虚,外邪侵袭,浊邪阻络,脉络不通是SSc的主要病因和病理基础,进而指出温阳化浊通络法是治疗SSc的主要方法,并从药理学的角度和临床的角度分析了基于肺脾肾-皮毛相关理论组方中药——温阳化浊通络方治疗SSc的理论基础。

温阳化浊通络方免疫抑制作用有效部位的筛选研究

目的:分离并筛选温阳化浊通络方治疗系统性硬化病免疫抑制作用的有效部位。方法:制备温阳化浊通络方水溶性部位、乙醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、乙醇部位等不同溶剂提取物。在体内研究中,采用小鼠迟发型超敏反应(DTH)模型,观察温阳化浊通络方不同提取部位对细胞免疫和体液免疫的影响;体外研究检测温阳化浊通络方不同提取部位对Con A及LPS诱导的小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响。结果:温阳化浊通络方水溶性部位和正丁醇部位能够明显减轻DTH小鼠耳肿胀、降低小鼠的脾指数和胸腺指数(P<0.01)。同时温阳化浊通络方水溶性部位和正丁醇部位不同剂量组均可抑制T、B淋巴细胞增殖,且呈一定剂量依赖性。结论:温阳化浊通络方治疗系统性硬化病免疫抑制作用的有效部位可能是水溶性部位和正丁醇部位。

基于STAT3信号通路调节Th17细胞增殖探讨温阳化浊通络方治疗系统性硬化病机制

目的:研究温阳化浊通络方对Th17细胞增殖的影响,探讨其对STAT3信号通路的调控作用,明确该方治疗系统性硬化病(SSc)的免疫调控机制。方法:收集SSc患者外周血,采用密度梯度离心法分离外周血单核细胞,人Th17分选试剂盒分选Th17细胞,同时制备温阳化浊通络方含药血清。荧光染料CFSE标记Th17细胞后,流式细胞术检测含药血清对Th17细胞增殖的影响。采用RT-qPCR和细胞免疫荧光技术检测含药血清对Th17细胞中JAK2、STAT3/p-STAT3 mRNA和蛋白表达的影响。结果:与空白组比较,各剂量含药血清组可剂量依赖性地抑制Th17细胞的增殖(P<0.01);阳性对照组对Th17细胞的增殖抑制作用介于含药血清低剂量和高剂量组之间(P<0.01,P<0.05);各含药血清组可剂量依赖性地降低JAK2和STAT3 mRNA和蛋白的表达,并可剂量依赖性地降低p-STAT3的表达(P<0.05,P<0.01);阳性对照组抑制JAK2和STAT3/p-STAT3表达的作用强于各含药血清组(P<0.01)。结论:温阳化浊通络方可抑制Th17细胞的增殖,其机制可能与抑制STAT3信号通路有关。

温阳化浊通络方调控DNA甲基转移酶对硬皮病患者Treg细胞增殖的影响

目的:研究温阳化浊通络方(WYHZTLF)对DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)及叉头翼状螺旋转录因子3(forkhead box protein 3,FOXP3)表达的影响,探讨其调控硬皮病患者调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)细胞增殖的作用机制。方法:用Wistar雌性大鼠制备温阳化浊通络方含药血清。收集硬皮病患者外周血,分选Treg细胞,用含药血清处理后,通过CCK-8法检测含药血清对Treg细胞增殖的影响,免疫荧光法检测FOXP3蛋白表达,qRT-PCR法和Western blot法检测DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA及蛋白表达。结果:与空白血清组相比,低、中、高剂量含药血清组均可促进Treg细胞的增殖,中、高剂量组促进作用更加显著(P<0.05,P<0.01);低、中、高剂量含药血清组均可促进FOXP3蛋白表达(P<0.01);中、高剂量含药血清组明显抑制DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表达(P<0.05);高剂量含药血清组显著抑制DNMT1蛋白表达水平(P<0.05),低、中、高剂量组显著抑制DNMT3A和DNMT3B蛋白表达(P<0.01,P<0.01)。结论:温阳化浊通络方促进硬皮病患者Treg细胞增殖可能与抑制DNMT1、DNMT3A和DNMT3B表达从而促进FOXP3表达有关。

温阳化浊通络方抑制FOXP3甲基化促进Treg增殖治疗系统性硬化病的作用机制

目的:研究温阳化浊通络方对FOXP3甲基化的影响,探讨其调控Treg细胞增殖治疗系统性硬化病(SSc)的作用机制。方法:收集SSc患者外周血,采用密度梯度离心法分离外周血单核细胞,用试剂盒分选Treg细胞,同时制备温阳化浊通络方含药血清。含药血清处理Treg细胞后,分别采用CCK-8检测Treg细胞增殖,qRTPCR检测FOXP3和IL-10 mRNA表达,Western blot检测FOXP3蛋白表达,ELISA法检测IL-10水平,甲基化特异性PCR检测FOXP3基因启动子区和TSDR区甲基化水平。结果:与空白组比较,温阳化浊通络方低、中、高剂量组显著促进Treg细胞的增殖(P<0.05,P<0.01),促进IL-10 mRNA和FOXP3蛋白表达(P<0.05,P<0.01);温阳化浊通络方高剂量组显著促进FOXP3 mRNA表达(P<0.01),抑制FOXP3 TSDR区甲基化水平(P<0.05);温阳化浊通络方中、高剂量组显著增加IL-10水平(P<0.05,P<0.01)。结论:温阳化浊通络方可促进Treg细胞的增殖,其机制可能与抑制FOXP3甲基化、促进FOXP3表达有关。

温阳化浊通络方对硬皮病模型小鼠皮肤Th17细胞及相关细胞因子的影响

目的:探讨温阳化浊通络方对硬皮病模型小鼠皮肤T细胞辅助细胞17(Th17)及相关细胞因子的影响。方法:将60只小鼠随机分为空白组、模型组、miR-155antagomir抑制剂组(250 nmol/3 d)和温阳化浊通络方组(低、中、高剂量分别为21、42、84 g·kg^(-1)·d^(-1)),每组10只。使用盐酸博来霉素建立硬皮病模型。连续给药3周后,取小鼠皮肤组织进行HE染色、应用免疫组化检测白细胞介素(IL)-6和IL-17含量、应用流式细胞术检测Th17细胞比例、应用实时荧光定量PCR(qPCR)检测皮肤miR-155及IL-6、IL-17 mRNA的相对表达量。结果:S S C模型小鼠皮肤炎症水平远高于正常小鼠。免疫组化显示,硬皮病模型组I L-6、I L-17含量高于正常小鼠(P<0.01);温阳化浊通络方可有效降低IL-6、IL-17含量(P<0.01)。模型组皮肤CD4+IL17+Th17细胞比例,miR-155、IL-6及IL-17 mRNA相对表达量显著高于空白组(P<0.01,P<0.05),温阳化浊通络方中、高剂量组可有效降低上述指标(P<0.01)。结论:温阳化浊通络方可能通过抑制硬皮病模型小鼠皮肤miR-155、IL-6、IL-17基因表达,进而调控Th17细胞,影响皮肤成纤维细胞增殖,减缓硬皮病模型小鼠皮肤纤维化进程。