Western blot法检测CIN宫颈液基细胞残液中HPV16、18E6感染的临床意义

目的:探讨免疫印记法(Western blot)检测子宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasis,CIN)宫颈液基细胞残液中人乳头状瘤病毒(human papillomaviruses,HPV)16、18E6感染的临床意义。方法:采用Western blot法检测经病理证实的86例CIN和14例慢性宫颈炎的宫颈液基细胞残液中HPV16、18E6的感染状况。结果:宫颈液基细胞残液中HPV16、18E6感染的阳性率分别为CINⅠ组33.3%(8/24);CINⅡ组46.7%(14/30);CINⅢ组59.3%(19/32)。慢性宫颈炎(对照组)阳性率7.1%(1/14)。CINⅠ组与对照组比较差异无显著性(P>0.05),CINⅡ组和CINⅢ组与对照组比较均有统计学差异(P<0.05)。结论:Westernblot法检测CIN患者宫颈液基细胞残液中HPV16、18E6感染可以补充细胞学检查结果,对预防宫颈癌发生及降低其死亡率有重要意义。

人血浆转甲状腺素蛋白的提纯及其对肝癌细胞生长的抑制作用

目的:在人原发性肝癌中,转甲状腺素蛋白(transthyretin,TFR)基因转录严重受阻遏.在原发性肝癌患者的血浆中,TTR含量明显降低.因此,有必要从人血浆中提取TTR,观察TIR对人肝癌细胞生长的抑制作用.方法:先用40%饱和硫酸铵,再用5%酚预沉淀人血浆,采用DEAE-Cellulose离子交换层析提取TTR,所提蛋白经蛋白质印迹鉴定并于体外观察TTR对肝癌细胞生长的抑制作用.结果:从血浆中提取的TTR纯度为85%,经蛋白质印迹鉴定正确;体外实验初步证实,TTR对肝癌细胞的生长有明显抑制作用.结论:TTR对肝癌细胞的生长有明显抑制作用,这一性质为生物工程生产TTR,用于临床治疗,提供了可行性依据,从而在蛋白水平进一步证实TTR基因可能是与人肝癌相关的抑癌基因候选者.

薇甘菊水杨酸羧甲基转移酶基因的分离鉴定及表达分析

为研究水杨酸羧甲基转移酶基因在植物防御系统中的作用,采用RACE法从薇甘菊(Mikania micrantha)cDNA文库中克隆到薇甘菊水杨酸羧甲基转移酶基因SAMT全长cDNA,并进行外源表达以及水杨酸诱导模式分析。结果表明,该基因cDNA全长1299 bp,其中编码区长1089 bp,编码362个氨基酸,Blast显示该基因编码的氨基酸序列与仙女扇(Clarkia breweri)的相似性为74%,证实其主要功能是将水杨酸(salicylic acid,SA)甲基化成水杨酸甲酯(methyl salicylate,MeSA),由此将该基因命名为MmSAMT,GenBank登录号为FJ869889。将MmSAMT编码序列克隆至pET-32a(+)载体,转化Rosetta-gami(DE3)中表达,SDS-PAGE显示单体分子量在40 kD左右,与预测结果一致。Western blot显示在20℃、0.05 mmol/L IPTG和180 r min-1下诱导6 h,可获得较多的可溶性蛋白质。对喷施100μmol/L SA薇甘菊叶片中MmSAMT的转录谱进行研究,该基因的诱导受到SA的激活,48 h的表达水平达最高,暗示MmSAMT可能通过催化合成MeSA引发系统获得性抗性,提高抗性防御的警戒等级。

香鱼补体成分C9基因的克隆、序列分析及表达

补体成分C9是构成膜攻击复合体引起靶细胞溶解破坏的重要组成成分。该文测定了香鱼C9 （aC9）基因的cDNA全序列, 序列全长2 125个核苷酸, 编码一个由592个氨基酸组成、相对分子质量为6.56×104的前体蛋白, N端22个氨基酸为信号肽序列。序列分析表明, aC9与虹鳟C9的氨基酸同源性最高, 达56.8%, 与其它鱼类C9的同源性介于40.9%~53.8%之间。aC9在健康香鱼肝、脾、肠、鳃和肌肉有表达, 其中在肝内的表达量最高。实时荧光定量PCR的结果显示, 鳗利斯顿氏菌侵染4 h后, 肝中aC9 mRNA表达量显著上调, 并随着时间的推移在16 h时达到峰值。Western blotting分析的结果显示, 鳗利斯顿氏菌侵染后香鱼血清中的aC9蛋白随着时间的推移呈显著上调。以上结果表明, 香鱼肝组织C9基因表达变化与鳗利斯顿氏菌的侵染密切相关,

红藻藻蓝蛋白对HL-60细胞生长的抑制作用

本文运用半固体琼脂培养法及 MTT法研究了红藻藻蓝蛋白 (R- PC)对 HL- 60细胞生长的影响 ,结果发现 :R- PC能够显著抑制细胞的生长 ,且存在浓度效应和时间效应关系。为进一步探索 R- PC抑制 HL- 60细胞生长的可能机制 ,将不同浓度的 R- PC与 HL- 60细胞相互作用 6d后 ,分别用流式细胞仪检测 HL- 60细胞所处细胞周期中的时相和免疫印渍法测定 HL- 60细胞中 Bcl- 2基因表达产物的变化 ,实验结果显示 :R- PC确能使更多的 HL- 60细胞滞留于细胞周期的 G0 - G1 期 ,但与 R- PC浓度无正向关系 ,且 HL- 60细胞中 Bcl- 2基因表达产物的量也没有明显的变化。结果表明 :R- PC可能通过不同于 G0 - G1 期滞留及 Bcl- 2基因表达的机制抑制 HL- 60细胞的生长。

水稻矮缩病毒基因组第八号片段的cDNA克隆序列分析及在大肠杆菌中的表达

从水稻矮缩病毒（ＲＤＶ）中国福建分离物中分离出基因组第八号片段ｄｓＲＮＡ，经逆转录合成ｃＤＮＡ，应用聚合酶链式反应技术扩增了编码区ｃＤＮＡ，并克隆在ｐＧＥＭ３Ｚｆ（一）载体上。该片段编码病毒外层外壳蛋白。对重组子进行限制性内切酶分析，亚克隆及全序列测定，结果表明，克隆片段全长１３５ｂｐ含有一个１２６６ｂｐ的阅读框架，编码一个含有４２１个氨基酸的多肽。与日本流行株相应片段比较，核苷酸和氨基酸水平的同源率分别为９４．４％和９７．９％。另外，我们所克隆的片段在距起始密码子５３２一５３４处较日本株系多了３个核苷酸，导致ＲＤＶ中国福建分离物外层外壳蛋白比日本株多出一个氨基酸。将该编码区ｃＤＮＡ克隆到原核表达载体ｐＴｒｃＨｉｓＡ上，经ＩＰＴＧ诱导，用ＲＤＶ抗体进行蛋白Ｗｅｓｔｅｍ印迹分析表明，该基因在大肠杆菌中得到高效表达。这项工作为以后进一步开展水稻抗矮缩病基因工程，研究ＲＤＶ与传毒介体昆虫之间的识别关系奠定了基础。

不同治则中药复方对胆汁淤积性肝纤维化大鼠尿激酶型纤溶酶原激活剂的影响

目的观察补益肝肾、活血化瘀方二至丸、失笑散及其合方对胆汁淤积性肝纤维化大鼠肝组织尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)的影响。方法采用胆管结扎复制胆汁淤积性肝纤维化大鼠模型。造模大鼠于术后1周随机分为模型组、优思弗组、二至丸组、失笑散组及合方组;各药物干预组分别给予相应药物灌胃,模型组和假手术组给予等量生理盐水灌胃,至4周末处死全部动物取材。观察各组大鼠一般情况、肝功能(ALT、AST、ALP、TBil)、肝组织病理、uPA蛋白表达(Westernblot法)。结果与假手术组比较,模型组大鼠ALT、AST、ALP、TBil、纤维化程度均显著升高。与模型组比较,3个复方均能降低大鼠血清ALP、ALT、AST水平(P<0.01),失笑散及合方能降低TBil(P<0.01),合方改善ALP、ALT优于两个单方。3个复方均能不同程度地减轻模型大鼠肝纤维化程度(P<0.01),合方优于两个单方。优思弗能降低ALT、AST水平,但对肝脏纤维化无明显改善作用。与模型组比较,3个复方组uPA蛋白表达显著增加(P<0.01),其中合方组最高,失笑散组次之,再次为二至丸组,三者之间比较差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论二至丸、失笑散及其合方均可不同程度地干预胆汁淤积性肝纤维化形成,其机制可能与调控uPA蛋白表达有关。

巴氯芬抑制CCI神经病理性疼痛模型大鼠DRG神经元上GABA_A受体功能

目的：观察巴氯芬干预前后GABAA受体γ2亚基在坐骨神经压榨性损伤（Chronic ConstrictionInjury,CCI）模型大鼠背根神经节（Dorsal Root Ganglion,DRG）神经元上的功能和表达变化.方法：制备CCI模型,热板实验检测热刺激缩足反射潜伏期（Thermal Withdrawal Latency,TWL）;以灌胃的方式给予CCI模型鼠巴氯芬干预14天,取大鼠L4～L6 DRG神经元进行膜片钳实验,观测巴氯芬干预前后CCI模型鼠DRG神经元GABA介导的内向电流变化;应用Western blot技术检测巴氯芬干预前后CCI模型鼠GABAA受体γ2亚基的表达变化.结果：（1） CCI模型大鼠的TWL比正常组明显缩短,巴氯芬干预组模型大鼠的TWL较CCI模型组明显延长（P＜0.05）;（2）巴氯芬抑制CCI模型大鼠D RG神经元GABA介导的内向电流（P＜0.05）; （3） CCI手术侧和手术对侧DRG神经元上GABAA受体γ2亚基的表达量下调（P＜0.05）,但是磷酸化γ2亚基表达量上调（P＜0.05）;巴氯芬干预后的GABAA受体γ2亚基表达量较CCI组下调,磷酸化的γ2亚基表达量较CCI组上调.结论：神经病理性痛状态下,GABAA受体γ2亚基发生磷酸化可能是GABA介导的突触前抑制作用减弱的原因之一,而巴氯芬可能通过磷酸化GABAA受体γ2亚基抑制GABAA受体功能.

梭子蟹过敏原致敏组分的分析研究

目的应用免疫印迹(Western blotting)的方法分析梭子蟹[Portunus pelogicus(Linnaeus)]的致敏组分,为蟹过敏原的纯化和标准化变应原疫苗的研制提供理论依据。方法取常规方法制备的梭子蟹浸出液,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,用考马斯亮蓝染色分析其抗原蛋白的组分,同时用对蟹过敏的病人血清进行免疫印迹。结果SDS- PAGE显示梭子蟹可辨有19条蛋白带,分子量在13kD-90kD之间,其中主带有9条,分子量是20.9kD、24.2kD、27.1kD、29.2kD、33.7kD、38.9kD、48.7kD、74.7kD、89.1kD。Western blotting结果表明,16例蟹过敏患者血清全部呈阳性反应,浸出液中共有5条致敏条带,其中分子量在74.4kD、48.7kD的是主要致敏组分,阳性反应率均为100%。结论梭子蟹74.4kD和48.7kD组分为主要过敏原。

儿童横纹肌肉瘤中Myogenin蛋白的检测及其诊断价值

目的 :横纹肌肉瘤是儿童期最常见的软组织肉瘤 ,因其组织学常呈现低分化状态 ,故与其它儿童小圆细胞瘤的鉴别诊断十分困难。本实验初步探讨应用Westernblotting方法检测生肌转录因子基因家族成员之一—Myogenin蛋白以作辅助诊断的可行性。方法 :提取 8例横纹肌肉瘤及 2 0例其它儿童实体肿瘤新鲜组织中的蛋白质 ,进行SDS—PAGE电泳 ,然后将蛋白转移至硝酸纤维膜 ,作Westernblotting蛋白质杂交 ,对印迹进行分析。结果 :8例横纹肌肉瘤均有明显的Myogenin蛋白印迹 ,在 1例肾母细胞瘤中呈假阳性 ;用Westernblotting方法可检测到仅 5 μg组织蛋白中Myogenin蛋白的表达。 结论 :用Westernblotting方法检测Myogenin蛋白对于横纹肌肉瘤具有极高的灵敏度和较好的特异性 ,因而有一定诊断应用价值。

安徽地区献血人群HTLV感染调查

目的了解安徽地区无偿献血人群人类T淋巴细胞病毒感染状况,为本地区临床用血提供合适的安全筛查策略。方法对安徽省合肥、蚌埠、芜湖、安庆、马鞍山5地区部分献血人群采用ELISA试剂筛查HTLV-Ⅰ/Ⅱ抗体,筛查阳性标本采用蛋白印迹法(Westem blot,WB)确证和核酸检测,同时对献血者进行追踪、检测。结果 5地区共抽检献血者标本100 840份,ELISA法筛查出阳性标本57份,确证结果"不确定"2份,其余全部为阴性;确证阳性率为0%;追踪到献血者8人,结果7人仍为原ELISA试剂筛查阳性,确证结果均无阳性。结论安徽地区为HTLV低流行地区,可以暂不开展献血者HTLV全面筛查。

阿霉素诱导Jurkat白血病细胞凋亡及上调Fas配体和Fas相关死亡域(英文)

目的研究阿霉素诱导白血病细胞凋亡的剂量及时间关系,探索其相关的分子机制。方法分别以0.1、0.2、0.5、1.0 mg/L的阿霉素处理人类Jurkat白血病细胞61、22、44、8 h。其中一份样本在加入0.2 mg/L阿霉素前用zVAD-fmk(苄氧羰-缬氨酰-丙氨酰-天冬氨酰-氟甲基酮)预处理。应用AnV/PI双染细胞,在流式细胞仪上分析AnV/PI双阳性的凋亡细胞。采用Western Blot技术检测FasL和FADD(Fas相关死亡域)的表达。结果6 h时所有剂量的阿霉素诱导的凋亡细胞无显著差异(P>0.05),在12 h,只有1.0 mg/L诱导细胞明显凋亡。当细胞与0.2和0.5 mg/L的阿霉素共同培养24 h或36 h,观察到调亡细胞显著增加(P<0.001)。在zVAD-fmk存在的情况下,当细胞与阿霉素一同培养时,由阿霉素诱导的细胞凋亡完全受到抑制(P<0.001)。随着阿霉素作用时间增加,FasL和FADD表达水平相应增加。结论在阿霉素诱导的白血病细胞凋亡中,阿霉素以剂量和时间依赖方式诱导细胞凋亡;上调FasL可能启动FasL信号通路的激话,而caspase是最终的执行者。

刀额新对虾变应原的分离、鉴定与纯化

目的通过对我国常见的刀额新对虾变应原蛋白进行分离、鉴定与纯化,以提供虾特异性变应原用于食物变态反应疾病的诊断和治疗。方法通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离刀额新对虾的蛋白质组分并测定其分子量,收集过敏病人血清,采用免疫印迹(Western-blotting)法鉴定其变应原成分,通过离子交换层析对刀额新对虾变应原进行初步纯化,通过疏水层析和凝胶过滤层析进一步对变应原纯化。结果刀额新对虾有17条蛋白带,其中主要条带有10条,68和36 kD为可与虾过敏性病人血清IgE结合的特异性变应原;通过各种层析方法纯化出刀额新对虾68 kD变应原,纯度为96%。结论对刀额新对虾变应原进行分离、鉴定和纯化,得到高纯度的68 kD刀额新对虾变应原,为临床虾变态反应疾病的诊断和治疗奠定基础。

Livin蛋白在乳腺癌中的表达及与Bcl-2的关系

目的探讨凋亡抑制基因Livin和Bcl-2蛋白在乳腺癌组织中表达及与临床病理参数的关系。方法应用western blot和免疫组织化学SP法检测90例乳腺癌、30例乳腺良性病变和15例乳腺癌旁组织中Livin和Bcl-2蛋白的表达情况,分析两种蛋白表达的相关性。结果Livin蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达率及蛋白表达量明显高于癌旁组织和乳腺良性病变,差异有显著性(P<0.05)。Livin蛋白在乳腺癌中的阳性表达与肿瘤大小,组织学类型,组织学分级及淋巴结转移无关(P>0.05),但随临床分期的增加而升高(P<0.05);Livin和Bcl-2蛋白在乳腺癌组织中的表达显著相关(P<0.05)。结论Livin蛋白在乳腺癌组织中表达上调,且与病理分期有关,提示Livin蛋白可通过抑制细胞凋亡促进乳腺癌的发生、发展,Livin与Bcl-2蛋白可能在乳腺癌的演进中起着协同作用。

肿瘤细胞表面抗原的单克隆抗体-免疫沉淀筛选法

目的筛选新的肿瘤特异性抗原,为探索新的肿瘤诊断标志物和肿瘤疫苗奠定基础。方法将人宫颈癌细胞系Hela细胞免疫BALB/c小鼠,制备杂交瘤,应用杂交瘤培养上清对人结肠癌细胞系Colo205、人Burkitt淋巴瘤细胞系Raji等细胞进行红细胞花环形成实验以筛选阳性杂交瘤。应用Colo205、Raji、人肺癌细胞系PLA801、人胃癌细胞系7901、人T细胞白血病细胞系Jurkat、小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0等肿瘤细胞系、胚胎细胞系人胚肾上皮细胞系293T、人脐静脉内皮细胞系ECV304和健康人外周血单个核细胞(PBMC)等对所筛选的单克隆抗体进行活细胞免疫荧光染色和流式细胞仪鉴定单克隆抗体对多种细胞系膜表面天然抗原的识别情况,同时应用免疫沉淀法和Western blotting检测所筛单克隆抗体对细胞膜抗原的识别。结果采用红细胞花环形成实验从制备的抗体中成功筛选出3株单克隆抗体,流式分析显示其可同时识别Hela、293T、ECV304、Raji和Colo205细胞,但却不能识别Jur-kat、PLA801、7901、SP2/0细胞以及静止或活化的人PBMC。Western blotting证实这3株抗体可识别表达于Hela、Raji细胞膜的分子量约为47kD的膜蛋白。结论成功地制备了3株可识别肿瘤抗原候选分子的mAb,为筛选和鉴定肿瘤特异性抗原提供了有力手段。

膜孕激素受体(mPRα)在半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)卵母细胞成熟过程中的表达特征

通过实时荧光定量PCR方法(qRT-PCR)检测半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)雌性性成熟不同时期、不同时相卵母细胞中膜孕激素受体(mPRα)的表达,通过qRT-PCR和Western blotting方法检测促性腺激素(HCG)对成熟期半滑舌鳎卵母细胞mPRα表达的影响,同时,采用原位杂交、免疫组化和Western blotting方法研究雌性性成熟半滑舌鳎mPRα mRNA和蛋白在各组织中的表达。对半滑舌鳎性成熟不同时期、不同时相卵母细胞中mPRα mRNA的定量研究结果显示,在成熟时期半滑舌鳎Ⅴ时相卵母细胞的mPRα mRNA表达量最高。HCG对成熟期半滑舌鳎卵母细胞mPRα表达的影响研究结果显示,20 IU/ml HCG比10 IU/ml HCG对成熟时期半滑舌鳎卵母细胞mPRα mRNA和蛋白表达的促进作用更明显,进一步证明mPRα介导孕激素参与了卵母细胞成熟的调控。对mPRα组织表达的定量和定位研究中,Western blotting结果显示,在半滑舌鳎的卵巢、垂体、脑、头肾、肾、肝脏组织中均有mPRα蛋白表达,且在脑、垂体和卵巢中表达量较高,表明mPRα在不同组织中都发挥着一定的作用,且在内分泌相关组织如脑、垂体和卵巢中的作用更明显。原位杂交和免疫组化结果显示,mPRα mRNA和蛋白表达明显定位在卵母细胞膜上,且在其他组织的外周和管腔结构表达。本研究为进一步研究mPRα在膜上的信号转导机制提供了理论基础和形态学依据。

抗人DR5功能性单克隆抗体诱导Jurkat细胞凋亡的线粒体途径的分子机制

目的:探讨抗人死亡受体5(DR5)功能性单克隆抗体(mDRA-6)对Jurkat细胞诱导凋亡的线粒体途径的分子机制。方法:MTT法检测单克隆抗体(mDRA-6)对Jurkat细胞生长抑制作用的剂量-效果及时间-效果关系;JC-1单染流式细胞术定量分析技术对凋亡的Jurkat细胞线粒体膜电位的变化进行分析;免疫印迹技术检测凋亡细胞的Caspase-8、3、9及Bid、Bax、Bcl-2、Cytoc等凋亡相关蛋白的表达情况。结果:mDRA-6对Jurkat细胞抑制具有明显剂量-效果和时间-效果关系;流式细胞仪检测显示,2.0μg/ml浓度的mDRA-6作用15、30、60和120分钟时,Jurkat细胞线粒体膜电位改变率分别为20.14%、19.34%、21.11%、30.90%,呈逐渐增高趋势。免疫印迹技术检测显示,mDRA-6作用后,Jurkat细胞Caspase-8、9及Bid、Bax、Bcl-2、Cytoc等表达活性增加,并且Cytoc在线粒体内为递减而在胞浆呈递增的表达现象。结论:mDRA-6通过激活外源性膜受体,继而启动细胞线粒体途径导致Jurkat细胞凋亡。本研究为mDRA-6对白血病治疗奠定实验基础。

丝裂原活化蛋白激酶在卵巢癌中的表达及意义

目的：探讨丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的三个亚族ERK1、JNK1、p38在卵巢癌中表达的意义及三者之间的关系。方法：应用免疫组化及Western bloting印迹分析的方法，检测ERK1、JNK、p38在50例卵巢上皮癌、30例卵巢良性上皮性肿瘤和30例正常卵巢组织中的表达，判断ERK1、JNK1、p38与临床病理因素的关系，明确MAPKs亚族间的相关性。结果：JNK1、p38在Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌组织中的表达明显高于正常卵巢组织和卵巢良性上皮性肿瘤（P〈0．05）。ERK1在Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌组织中的表达明显高于正常卵巢组织和卵巢良性上皮性肿瘤（P〈0．05）。JNK1与p38蛋白阳性率呈明显的正相关（P〈0．05）。结论：MAPKs不同亚族在卵巢癌的发病学中起到重要作用，并与卵巢癌期别有关。

犬瘟热病毒F蛋白基因片段的克隆与表达及其表达产物抗原性的初步鉴定

本研究采用RT-PCR法扩增出犬瘟热病毒标准疫苗株的融合蛋白基因(F基因)片段约1499 bp,克隆到pMD18-T载体,酶切鉴定后用一对特异性的引物扩增约732 bp的F蛋白基因片段。并把该基因定向克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,转化到宿主菌BL21(DE3)后进行了表达并纯化了该表达产物,Western印迹显示表达产物有良好的抗原性。