以结果验证为导向的中医学八年制Western Blot实践教学

“实验中医学”是海军军区大学中医学八年制学员的主干课程。其中Western Blot是研究蛋白水平的基本方法,也是学员所必须掌握的实验研究方法。本课程以结果验证为导向的教学方式革新,最大限度压缩每个步骤的操作时间,聚焦于让学员完成最多的实验步骤,力求实验的完整性。该方法可在一堂课完成实验,展示结果并进行分析讨论。该教学方式有助于在最短时间内掌握完整的Western Blot实验技术,值得进一步推广应用。

重组N蛋白抗原检测PRRSV抗体ELISA的研究 Ⅳ.与IDEXXELISA试剂盒及Westernblot的比较

利用重组N蛋白抗原建立了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的ELISA方法并组装成试剂盒,将试制的3批试剂盒分别与IDEXX生产的试剂盒及Western-blot进行了符合率试验。试验结果表明,所研制的试剂盒与Westernblot的符合率达97.67%以上。对460份临床血清分别用自制的试剂盒和IDEXX公司生产的试剂盒进行检测,其中有37份不相符合,用Westernblot对这37份血清进行验证,有35份血清检测结果与自制的试剂盒检测结果一致。由此表明,自行研制的试剂盒,其特异性和敏感性均能满足目前临床上该疫病的流行病学分析或免疫抗体检测。

定量PCR和Western blot结合检测回药爱康方对肺癌细胞EGFR、NF-κB的表达影响

目的:探讨定量PCR和Western blot结合检测对Lewis肺癌C57小鼠瘤细胞表皮生长因子受体(EGFR)、NF-κB表达影响,观察该方对调节癌细胞信号转导作用机制。方法:小鼠自接种瘤株细胞24 h后称重、编号,随机分为8组,每组5只,分别为:1回药高剂量组(AKH);2荷瘤模型组(对照组);3回药中剂量组(AKM);4单纯化疗药组(CTX组);5回药中剂量组加化疗组(AKM+CTX);6回药低剂量加化疗药组(AKL+CTX);7回药低剂量组(AKL);8回药高剂量加化疗药组(AKH+CTX)。采用RT-PCR和western blot方法检测小鼠组织样本中EGFR、NF-κBm RNA转录水平和蛋白质表达的变化情况。结果:实时荧光定量PCR结果显示:与模型组小鼠比较,给予回药爱康方,高、中、低剂量干预后,小鼠瘤细胞中EGFR m RNA表达水平显著下调(P<0.01),而低剂量对NF-κBm RNA的表达水平无统计学差异(P>0.05),给予回药爱康方,高+CTX、中+CTX、低+CTX、CTX后,小鼠瘤细胞中EGFR表达水平显著下调(P<0.01),小鼠瘤细胞中NF-κBm RNA表达水平显著上调(P<0.01);与模型组比较,给予回药爱康方高、中、低剂量干预后,Lewis肺癌C57小鼠EGFR、NF-κB蛋白表达水平无统计学差异性(P>0.05),给予回药爱康方高+CTX、中+CTX、低+CTX、CTX干预后,Lewis肺癌C57小鼠EGFR蛋白表达水平显著下调、NF-κB蛋白表达水平显著上调(P<0.01或P<0.05)。结论:回药爱康方高、中、低与回药开康方高+CTX、中+CTX、低+CTX、CTX均对EGFRm RNA的表达水平有影响,仅低剂量对NF-κBm RNA的表达水平无影响,同时回药爱康方高、中、低剂量均对EGFR、NF-κB蛋白表达无影响。

疯牛病和羊痒病Western blotting检测方法的建立

以朊蛋白单抗AH6和碱性磷酸酶标记的马抗鼠酶标二抗建立了疯牛病和羊痒病的Western blotting检测方法。对Western blotting各种反应条件进行摸索,并确定了最佳工作条件,结果表明:匀浆缓冲液为RIPA时的最佳反应条件包括浓缩胶电泳电压为恒压90V,分离胶电泳电压为恒压160V,转印的最佳电压和时间为恒压100V1.5h;封闭液为3%BSA时,封闭15min,封闭效果最好;AH6的最佳稀释度为1∶4000,4℃下孵育过夜,马抗鼠二抗的最佳稀释度1∶1000,室温下孵育30min。采用已确立的反应条件对样品进行检测并与Prionics-Check WEST-ERN进口试剂盒的检测结果比较,发现其敏感性为100%,特异性为99.4%,与进口试剂盒(100%,100%)无显著差异,这为国产试剂盒研制提供了条件。

拟南芥DBB1a(double B-box 1a)蛋白的表达、纯化及Western blotting检测

PCR扩增拟南芥(Arabidopsis thaliana)DBB1a cDNA的保守区段(GenBank登录号:AT2G21320),转化到冷诱导表达载体pCold TF上,构建pCold-DBB1a重组质粒,转化大肠杆菌DH5a。15℃下IPTG诱导表达融合蛋白,并通过SDS-PAGE检测。证实目的蛋白以可溶形式在约20 kD处高效表达,与预期蛋白大小相吻合。表达蛋白经Ni琼脂糖凝胶亲和层析纯化,SDS-PAGE及Western blotting检测证实纯化后获得高纯度融合蛋白,这为进一步研究DBBl a功能奠定了基础。

麻疯树外植体愈伤组织中毒蛋白的Western-blot鉴定

The proteins from endosperm, root, stem, leaf, leafstalk of Jatropha curcas L. and their calli were hybridized to the seed toxin protein (curcin) of Jatropha curcas L. by western blot. The result showed that the curcin was specifically expressed in the endosperm and its calli, while it was not detected in root, stem, leaf, and leafstalk of Jatropha curcas L. and their calli . This study indicated that calli induced from endosperm can be used to produce curcin.

固定后乳腺癌细胞雌激素受体和孕激素受体的FCM和Westernblot检测

背景与目的:雌激素受体(estrogenreceptor,ER)和孕激素受体(progesteronereceptor,PR)水平的定性、定量检测,对乳腺癌患者预后判断和内分泌治疗效果的评价具有重要意义。Westernblot法和流式细胞术(flowcytometry,FCM)是蛋白质定性、定量分析的重要手段,但常规Westernblot法要求提取新鲜样本的蛋白质。本研究拟建立固定后乳腺癌细胞ER和PR的Westernblot检测方法,探索Westernblot法和FCM对同批固定样本ER、PR进行同步分析的可行性。方法:取不同乳腺癌细胞株对数生长期新鲜细胞和固定细胞的蛋白提取物,分别用ERα单克隆抗体1D5和PR单克隆抗体PgR636以Westernblot法对ER、PR的表达情况进行检测,并与同期固定细胞的FCM检测结果进行比较。结果:经Westernblot法检测,T-47d、MCF-7、ZR-75-1细胞可见分子量正确的ERα清晰条带,固定T-47d和ZR-75-1细胞的ERα条带较新鲜细胞的条带浓,MM231细胞ERα检测为阴性;T-47d和ZR-75-1细胞可见清晰且分子量正确的PR条带,固定细胞的PR条带较新鲜细胞的条带浓,MM231和MCF-7细胞PR检测为阴性;同期固定细胞ER、PR阳性表达的FCM检测结果与Westernblot检测结果一致。结论:不同乳腺癌细胞在经0.25%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)和75%乙醇固定后,可用于ER、PR的FCM定量检测。

以融合蛋白为抗原的简化Westernblot法诊断囊虫病

目的：为囊虫的诊断提供简便有效的方法。方法：猪囊尾蚴ｃＤＮＡ表达文库中筛选出的β－半乳糖苷糖－猪囊虫ｃＤＮＡ编码的融合蛋白为抗原，进行简化的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析。结果：四个克隆的融合蛋白（ｃＣ１、ｃＣ２、ｃＰ１和ｃＨ１）联合使用，检测１２４例人囊虫病血清中的抗囊尾蚴ＩｇＧ抗体，阳性率达９３．７％，三个克隆的融合蛋白（ｃＣ１、ｃＣ２、和ｃＰ１）联合使用，检测３８例猪囊虫病血清中的相应抗体，阳性率达１００％，均高于各克隆融合蛋白单独使用的阳性率，且与其他寄生虫病血清无交叉反应。结论：以融合蛋白为抗原所进行的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析具有高度灵敏性和特异性，且简便易操作。

Western Blot和流式细胞术检测磷酸化STAT3的比较

目的对Western Blot和流式细胞术(Flowcytometry,FCM)这两种磷酸化STAT3的检测方法进行比较。方法用不同浓度的白细胞介素5(interleukin 5,IL-5)刺激人早幼粒细胞白血病细胞株HL-60,活化细胞内的STAT3,然后分别用Western Blot和流式细胞术进行检测。结果 Western Blot与流式细胞术的检测结果一致。结论 Western Blot与流式细胞术用于磷酸化STAT3的检测各有优势,可以互为补充。

Western blot方法检测胞质中细胞色素C含量的改进

目的探讨用Western blot技术检测胞质中细胞色素C(Cyt C)的最佳转膜时间。方法取大鼠小肠上皮细胞,提取胞质蛋白。蛋白定量后,取20μg样品上样于聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。取22μm孔径硝酸纤维素膜(NC膜),电压100 V,分别电转移15、30、60、90、120 min。NC膜用丽春红染色,蒸馏水漂洗后加入Cyt C一抗、二抗孵育,放射自显影显色。结果在转膜过程中,随着时间的增加,转移到NC膜的总蛋白增多;而Cyt C条带出现了先增加(30 min),后减少,再增加(120 min)的趋势。结论 Cyt C虽然是小分子量蛋白,但Western blot的转膜时间并不需要减少,相反要增加到120 min才能得到最佳效果。

利用正交设计优选NR2A的Western Blot成像条件

采用L9(34)正交设计法,测定了不同光圈、焦距、曝光时间下成像的条带和背景灰度值,探讨了光圈、焦距、曝光时间对NR2A的Western Blot成像效果的影响.结果表明,光圈和曝光时间的影响具有显著性,NR2A的最佳成像条件是光圈为4mm、焦距为30mm、曝光时间为60s.

Western blot法诊断囊虫病的应用研究

目的：探讨四种猪囊尾蚴（Ｃｙｓｔｉｃｅｒｃｕｓｃｅｌｕｌｏｓａｅ）特异性抗原ｃＣ１、ｃＣ２、ｃＰ１、ｃＨ１（分子量分别为２８ｋＤａ、１８ｋＤａ、１４ｋＤａ、３４ｋＤａ）混合应用诊断人囊虫病的价值。方法：以猪囊尾蚴ｃＤＮＡ表达文库中筛选出的β－半乳糖苷酶－猪囊虫特异性抗原ｃＤＮＡ编码的融合蛋白（ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＦＰ）为抗原，作简化的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ（ｉｍｐｒｏｖｅｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，ＩＷＢ）分析，检测１０７例囊虫病、４０例华支睾吸虫病、２４例包虫病和３４例健康人血清对融合蛋白的反应。同时应用粗制抗原（ｃｒｕｄｅａｎｔｉ－ｇｅｎ，ＣＡ）进行ＥＬＩＳＡ、ＩＨＡ对比检测。结果：在简化Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测中，ＦＰ被１０７例囊虫病患者血清中９４例（８７．９％）血清所识别，与华支睾吸虫病、包虫病患者及健康人血清无交叉反应，特异性为１００％。以粗制抗原作ＥＬＩＳＡ、ＩＨＡ检测囊虫病人血清中的ＩｇＧ抗体阳性率分别为８４．１％和７４．８％，与华支睾吸虫病患者血清存在交叉反应，假阳性率分别为２．５％、１２．５％；与包虫病患者血清存在交叉反应，假阳性率分别为８．３％、１６．７％；与健康人血清也存在交?

新孢子虫和弓形虫ELISA及western blot检测方法的建立及应用

为建立牛新孢子虫和弓形虫的免疫学检测方法,并调查新疆部分地区牛新孢子虫和弓形虫的感染情况,本研究应用纯化的新孢子虫重组蛋白SRS2(NcSRS2)和弓形虫重组蛋白SAG2(TgSAG2)作为包被抗原,分别建立新孢子虫和弓形虫的ELISA和western blot血清学检测方法,并进行特异性和重复性试验,以其检测662份疑似样品,并与商品化试剂盒检测结果比较验证。特异性和重复性试验结果表明,建立的方法特异性强、重复性良好。采用建立的两种ELISA方法对662份临床样品的检测结果表明,新孢子虫和弓形虫的抗体阳性率分别为13.44%(89/662)和5.29%(35/662);与IDEXX试剂盒和永辉试剂盒的符合率分别为94.11%和95.92%。此外,western blot检测的新孢子虫和弓形虫抗体阳性率分别为5.14%(34/662)和3.17%(21/662);与建立的ELISA检测方法的符合率分别为91.69%和97.89%。本研究为分析奶牛流产的原因提供了一定的依据。

运用FQ RT-PCR和Western blot检测Claudin-1在人类大肠癌细胞株的表达

目的:探讨密连接蛋白Claudin-1与人类大肠癌进展的关系。方法:采用实时荧光定量RT-PCR(FQRT-PCR)和Western blot,检测Claudin-1在3株不同分期人类大肠癌细胞株中的表达。结果:Claudin-1在大肠癌Dukes'type C期细胞株SW620强表达,Dukes'type B期细胞株SW480次之,Dukes'type A期细胞株SW1116最弱。结论:Claudin-1在人类大肠癌细胞株中有表达,其表达量与大肠癌分期有关。

免疫组化、Western blot蛋白印迹和免疫荧光染色观察磷酸鞘氨醇受体2大鼠海马中的表达变化

目的观察磷酸鞘氨醇受体2(S1PR2)基因在颞叶癫痫大鼠海马中的表达变化。方法将72只健康雄性Wistar大鼠随机均分为实验组(36例)和对照组(36例)。实验组使用氯化锂—匹罗卡品进行颞叶癫痫诱导制模,成功后持续大发作1h终止待检,对照组以相同剂量生理盐水注射,然后以进行免疫组化、Western blot印迹和免疫荧光染色检测并进行统计学分析。结果免疫组化检测结果显示,两组1d、3d、7d、28d、56d海马S1PR2阳性细胞计数相比有统计学意义(P<0.05);Western blot检测结果显示,两组3d、7d、28d、56d海马S1PR2蛋白表达水平相比有统计学意义(P<0.05);免疫荧光染色检测显示,S1PR2蛋白表达阳性为红色,星形胶质细胞为绿色,细胞核为蓝色。结论颞叶癫痫大鼠海马中S1PR2表达水平显著下降,说明颞叶癫痫发病机制可能与神经元功能、星形胶质细胞增生受到S1PR2影响有关。

显微切割联合全自动Western blot在小鼠大脑标记神经元微量蛋白定量中的应用

目的构建及评价收集特定部位的标记神经元,对这类神经元的微量蛋白水平采用定量的方法,并将此方法初步应用于小鼠颅脑创伤后海马亚区神经元中。方法硫堇染色未固定处理的冰冻切片脑组织神经元,激光显微切割收集海马CA1区和DG区神经元,全自动毛细管Western blot检测收集细胞的磷酸化蛋白激酶A(p-PKA)蛋白水平。结果全自动毛细管Western blot对低浓度蛋白的检测下限低于传统Western blot 1个数量级,其线性相关系数为98. 85%,日内和日间精密度分别为2. 50%和4. 09%。本方法应用于颅脑创伤小鼠脑组织,发现伤后1 d海马DG区神经元p-PKA显著增高(P <0. 01),CA1区无变化。结论本方法基于激光显微切割和全自动毛细管Western blot,能够实现精确收集指定神经元并准确定量微量蛋白,成功应用于目标神经元蛋白定量,具有在细胞类型众多且混杂分布的组织中进行细胞和分子水平研究的应用前景。

小麦TaBS1转录因子基因的克隆、原核表达及Western blot检测

转录因子在提高植物抗性中起着重要的作用。本实验从小麦中克隆得到一个新的具有DUF822保守域的转录因子基因TaBS1。为进一步研究该转录因子在参与植物胁迫信号调控中的作用以及蛋白本身的结构、功能和活性等,将TaBS1基因构建到原核表达载体pET-28a(+)上。在终浓度为1mmol·L-1IPTG诱导2h的条件下,得到融合蛋白His-TaBS1,并用Western blot确定所表达的蛋白确实为融合蛋白His-TaBS1。

冷刺激不同时间仔猪3种组织HSP70表达的Western blot检测分析

采用50日龄的雄性"军牧一号"仔猪进行冷刺激试验,分别在冷刺激0、0.5、3、6、12、24h与应激恢复0.5、3、6、12、24、48h共12个时间点采取仔猪肝脏、脾脏和股二头肌样品。利用Western blot检测冷刺激(-7±2℃)不同时间仔猪肝脏、脾脏与股二头肌HSP70的表达量,探讨冷刺激对机体3种主要器官内HSP70表达量的影响。结果显示仔猪肝脏、脾脏和股二头肌中HSP70的表达量都以不同程度的升高,而后呈现先下降再升高的变化趋势。结果提示肝脏、脾脏和股二头肌3种组织尤以肝脏HSP70表达量变化明显,提示冷应激反应中代谢最旺盛的器官肝脏中物质代谢可能与HSP70的表达量有关。

赤点石斑鱼诺达病毒的纯化及其衣壳蛋白的Western-blot分析

采用差速离心,蔗糖(10%～40%,W/V)密度梯度离心和氯化铯(30%～40%,W/W)等密度梯度离心法,对赤点石斑鱼诺达病毒大亚湾株(RGCN)进行了纯化,测定计算其浮密度为1.3102～1.3243g·cm-3。通过Westernblot法检测到的病毒的结构蛋白的分子量为37和31kDa,而以31kDa的蛋白为主。

快慢转法及不同滤膜和显色检测法在Western blotting中的应用分析

目的探讨快、慢转法及不同滤膜和显色检测法在Western blotting中的应用及各实验环节分析。方法采用MDA-MB-231细胞制备细胞蛋白,应用不同印迹膜[硝酸纤维素膜、聚偏乙烯二氟(PVDF)膜和阳离子尼龙膜]分别采用快转法和慢转法进行增强化学发光法(ECL)和DAB化学显色法检测,并对Western blotting的各实验环节进行了分析。结果(1)在快、慢转法中硝纤膜的蛋白预染marker条带略强于尼龙膜,而尼龙膜又略强于PVDF膜;PVDF膜和尼龙膜的正反面易于混淆,而硝纤膜的正反面不易混淆。(2)在快、慢转法中,PVDF膜的DAB化学显色法图像略强于尼龙膜和硝纤膜,而尼龙膜和硝纤膜无明显差异;与慢转法相比,快转的硝纤膜和尼龙膜中的蛋白条带略呈波浪状。(3)在慢转法中三种膜化学发光法的图像无明显背景,但在快转法中尼龙膜的背景较明显,而硝纤膜和PVDF膜亦无明显背景。结论应根据实验需要选用不同的印迹膜;慢转法通常优于快转法,增强化学发光法优于DAB化学显色法;增强化学发光法特异胜强、灵敏度高,是分析蛋白质表达较为理想的方法。