宽体金线蛭COI基因特异性引物的设计及验证

目的建立一种宽体金线蛭的聚合酶链式反应鉴别方法,实现对宽体金线蛭及其常见混伪品的快速鉴别。方法以细胞色素c氧化酶亚基I序列为基础,通过分析宽体金线蛭单核苷酸多态性位点,设计宽体金线蛭的特异性鉴别引物。对引物稳定性、引物特异性及灵敏度进行考察确认,同时将其应用于含水蛭的中成药中进行验证。结果使用宽体金线蛭特异性引物KT1-3或KT1-4均可特异性扩增宽体金线蛭的DNA,产物大小分别为235 bp和266 bp,而在其他非宽体金线蛭样品中无扩增条带。该方法对宽体金线蛭DNA的最低检测限为0.01 ng。使用该特异性引物对可在脑血栓片模拟制剂和部分市售脑血栓片中检测到宽体金线蛭。结论建立的DNA分子鉴定方法中宽体金线蛭引物对特异性强、灵敏度高,可作为水蛭药材传统基原鉴定方法的补充,为宽体金线蛭的快速鉴别提供支持。

宽体金线蛭基因组SSR序列特征分析及其分子标记开发

【目的】分析宽体金线蛭基因组SSR序列特征,并开发多态性SSR分子标记,为宽体金线蛭种质遗传多样性分析及良种选育等提供有效的分子标记。【方法】利用基因组de novo测序技术对宽体金线蛭基因组进行扫描,通过序列拼接得到基因组序列,利用Tandem Repeats Finder v4.09查找拼接序列SSR位点,分析SSR序列特征并使用PRIMER3 Input(version 2.3.7)设计引物,随机选择三碱基、四碱基和五碱基SSR分子标记引物50对对8份宽体金线蛭DNA样品进行PCR验证,并以多态性SSR分子标记分析宽体金线蛭江苏高邮群体遗传多样性。【结果】测序拼接共得到148803个scaffolds序列,scaffold序列长度181～564229 bp,平均1544 bp,总长度230 Mb,N50为5948 bp,GC含量36.94%。宽体金线蛭基因组中三碱基重复SSR位点最多,有136890个,占总SSR位点的68.43%;其次为四碱基重复,有33769个,占总SSR位点的16.88%;六碱基、五碱基、二碱基和单碱基重复分别有11813、7110、6546和3907个,占总SSR位点的5.91%、3.55%、3.27%和1.95%。基序为AAT/ATA/TAA/ATT/TTA/TAT的SSR位点数量最多,其次为ATG/TGA/GAT/TAC/ACT/CTA、AGT/GTA/TAG/TCA/CAT/ATC和AAC/ACA/CAA/TTG/TGT/GTT,其他基序位点数量较少。有11871个SSR位点设计出引物,占总SSR位点的5.93%;选择的50对引物中有18对引物在8份宽体金线蛭DNA样品中具有多态性;群体遗传多样性检测发现宽体金线蛭江苏高邮群体18个SSR位点的平均等位基因(Na)3.81个,观测杂合度(HO)为0.0000～0.6429,平均为0.3631,期望杂合度(He)0.0701～0.7792,平均为0.4869,群体遗传多样性水平低。【结论】采用高通量测序技术开发SSR分子标记效率高,且新开发的18个宽体金线蛭SSR分子标记多态性丰富,可用于宽体金线蛭资源保护和利用。

宽体金线蛭选育群体生产性状的选择效应

目的:为选育经济性状优良的宽体金线蛭新品种。方法:以江苏里下河地区野生宽体金线蛭为材料,以生长速度为指标,选择个体体重18.00 g以上构建宽体金线蛭选育群体,比较选育群体与普通群体繁殖及F1代养殖生产性状。结果:选育群体每10㎏亲蛭产茧1.81㎏,较普通群体提高了63.04%,卵茧规格较普通群体明显增大(P<0.01),亲蛭体重下降率及卵茧平均出苗率选育群体与普通群体无明显变化(P>0.05);选育群体F1养殖产量、均重及成活率较普通群体分别提高了55.69%、17.18%和33.17%,差异极显著,特定生长率及增重率明显高于普通群体(P<0.01),而干物质比2个群体F1代差异不显著(P>0.05)。结论:通过群体选育可以有效提高宽体金线蛭繁殖和养殖性能。

宽体金线蛭苗对萝卜螺和方形环棱螺仔螺摄食及生长特征研究

目的:弄清宽体金线蛭(Whitmania pigra)苗期最适饵料。方法:以宽体金线蛭苗(体质量0.1140±0.0424 g)作为研究对象,实验时间为20 d,分别投喂耳萝卜螺(Radix auricularia)(体质量0.1981±0.1113 g)和方形环棱螺(Bellamya quadrata)仔螺(体质量0.0356±0.0181 g),记录蛭苗对两种饵料的摄食数量,体重变化,水质变化等特征。结果:宽体金线蛭苗会积极采食萝卜螺和方形环棱螺仔螺,方形环棱螺仔螺组几乎无残饵,但萝卜螺组残饵较多;萝卜螺组体质量是方形环棱螺仔螺组的1.7倍;萝卜螺组饲养6 d内氨氮、亚硝酸盐、硫化物指标在第6天分别达到7.81±2.33 mg/L、2.11±0.81 mg/L、0.13±0.03 mg/L,显著高于方形环棱螺仔螺组。结论:萝卜螺和方形环棱螺仔螺两种饵料均是宽体金线蛭苗适口饵料,萝卜螺作为饵料生长速度更快,但残饵较多,水质容易败坏。

饥饿胁迫下宽体金线蛭苗生长特性研究

目的:研究饥饿胁迫后宽体金线蛭苗生长特性。方法:将孵出的宽体金线蛭幼苗进行饥饿处理,测定了其在饥饿胁迫下体重变化规律;并在不同饥饿时间点给予足量适口饵料,观察其摄食后的生长特性。结果:持续饥饿胁迫下,宽体金线蛭苗体重逐渐下降,和饥饿胁迫时间成负相关关系,相对负增重率呈现出阶段性增大的规律。饥饿12天内投饵后,幼苗会以高于正常投喂组的生长速度补偿生长,但饥饿14天以后补偿生长基本消失,仍可以正常速度生长,但生长过程中晚投喂组体重无法赶上或超过正常摄食组。结论:宽体金线蛭耐饥饿能力较强,解除饿胁迫后可以部分补偿生长形式继续生长。

凝血酶滴定法测定宽体金线蛭抗凝血活性的影响因素

对测定宽体金线蛭抗凝血活性的凝血酶滴定方法的影响因素进行分析。方法：用白瓷点滴板代替试管进行滴定反应（简称白瓷板法），考察白瓷板法和常规的试管法、不同凝血酶滴定间隔时间和凝血酶浓度对抗凝血活性测定的影响。结果：在同样条件下，白瓷板法测定抗凝血活性的精确度和稳定性较试管法高。用白瓷板法测定，宽体金线蛭样品浓度在一定范围内（0．125～0．333g·ml^-1）、凝血酶浓度为20u·ml^-1或10U·ml^-1时，每隔1min滴加1次，每次5μ1，样品浓度与消耗的凝血酶体积呈线性相关，r值分别为0．961和0．992；所测得样品的抗凝血活性分别为（33．08±2．64）和（31．24±1．32）U·g^-1．RSD分别为8．0％和4．2％；对于0．333g·ml^-1的样品，其测量产生的理论误差不大于10％和5％。结论：白瓷板法可用于测定宽体金线蛭样品的抗凝血活性，用10U·ml^-1的凝血酶溶液，每分钟滴加一次，每次5山进行测定，其线性和精确度均较好。

宽体金线蛭有效成分分子量分布和纯化工艺考察

目的:采用不同方法对宽体金线蛭活性溶液进行不同分子量的含量测定和物质分离,获得最优条件。方法:采用不同分子通透性的透析膜对宽体金线蛭活性溶液进行分子量的含量测定。再分别采用大孔树脂、Q Sepharose FF、SP Sepharose FF对宽体金线蛭活性溶液进行纯化。通过考察不同纯化条件以达到分离有效物质的目的,并结合体外抗凝实验对最佳组分进行活性检测。结果:分别采用500 Da、1000 Da、3000 Da的透析膜对活性溶液进行分子量含量测定,得出<500 Da的物质占37.6%;500 Da^1000 Da的物质占到18.5%;1000 Da^3000 Da的物质占28.1%;>3000 Da物质占到15.7%。采用大孔树脂DA201-C处理得出50%乙醇洗脱液具有很好的活性。再采用Q Sepharose FF、SP Sepharose FF分别对宽体金线蛭活性溶液进行处理,采用不同洗脱剂进行洗脱然后进行活性验证得出1.0%Na Cl的p H值=8.5的Tris缓冲溶液洗脱组分活性比较强。结论:采用不同方法对宽体金线蛭活性溶液进行研究,获得较纯的活性组分,为后期的继续研究做好基础。

基于斑马鱼模型比较宽体金线蛭和菲牛蛭对血管新生的影响

目的:探讨及比较宽体金线蛭和菲牛蛭对Tg(kdrl:m Cherry)斑马鱼的血管新生影响。方法:将受精后6~8 h(6~8hpf)的胚胎暴露在含不同浓度宽体金线蛭和菲牛蛭水提取物的胚胎培养液中,每24 h更换一次含药培养液。72 hpf时,在显微镜下观察发育形态和节间血管,测定48,72 hpf孵化率,72 hpf节间血管数目、心率。结果:在抑制血管新生方面,宽体金线蛭组浓度≥30μg·ml^(-1)时,菲牛蛭组浓度≥20μg·ml^(-1)时,斑马鱼节间血管数目均较空白组明显减少(P<0.01)。毒性方面,在48 hpf,给药组浓度≥40μg·ml^(-1)时,宽体金线蛭和菲牛蛭组斑马鱼的孵化率均较空白组明显降低(P<0.01);在72hpf,宽体金线蛭组斑马鱼的孵化率在100μg·ml^(-1)时较空白组明显降低(P<0.01),而菲牛蛭组斑马鱼的孵化率在80μg·ml^(-1)就明显降低(P<0.01)。宽体金线蛭和菲牛蛭组斑马鱼的卵黄囊、心囊无明显水肿,脊柱未弯曲;两组心率显著降低(P<0.01),但在正常心率范围内。结论:宽体金线蛭和菲牛蛭都具有抗血管生成活性,且菲牛蛭的抗血管生成活性强于宽体金线蛭。两者对斑马鱼发育有一定程度的影响,但毒性不大。

宽体金线蛭抗凝物质的提取与纯化

采用丙酮三氯乙酸法、凝胶过滤层析、阴离子交换层析、Sep-pak C18柱宽体金线蛭中抗凝物质进行分离与纯化,并且进行SDS-PAGE凝胶电泳。结果表明:SDS-PAGE电泳为单一条带,并且提取的物质具有抗凝活性,测序结果表明得到一种新的抗凝物质。

宽体金线蛭产茧后生长特性及主要消化酶活性研究

目的:研究宽体金线蛭产茧后生长特性及主要消化酶活性,为产茧后亲蛭处理提供理论依据。方法:选择性成熟宽体金线蛭利用网箱进行人工繁殖,繁殖结束后在室内条件下开展为期20 d的养殖实验,实验分饥饿组和对照组,养殖期间定期测量体重和统计成活率,养殖结束后测定出干率和主要消化酶活性。结果:饥饿组在实验期间不断死亡,最后平均成活率为51.67%;对照组前期亲蛭少量死亡,实验中后期持续死亡,养殖平均成活率为65.00%,与饥饿组之间差异显著。饥饿组实验初期体重迅速增长,之后逐渐下降,最后基本恢复到实验前水平,实验期间体重平均增长率为-0.53%;对照组在实验前期体重增加后出现小幅下降,之后体重持续增加,最后恢复到产茧前水平,实验期间体重平均增长率为40.23%。产茧结束后亲蛭出干率为22.14%,饥饿实验结束后饥饿组和对照组出干率分别为13.30%和12.75%,二者之间差异不显著,但与亲蛭产茧结束时出干率之间差异极显著。宽体金线蛭胰蛋白酶活性高于淀粉酶和脂肪酶活性,饥饿处理引起宽体金线蛭胰蛋白酶活性增强、淀粉酶活性下降,二者在饥饿组和对照组中差异显著。结论:宽体金线蛭产茧后短期养殖体重可以恢复到产茧前水平。

水蛭乙醇提取工艺的研究

以乙醇浸膏得率和浸膏中氮质量分数为评价指标,选择乙醇体积分数、乙醇与水蛭质量比、提取时间为考察因素,利用正交实验L9(34)确定乙醇提取水蛭最佳工艺条件为:φ(乙醇)=50%,m〔φ(乙醇)=50%〕∶m(水蛭)=6∶1,提取时间1 5h,共提取2次。平均乙醇浸膏得率13 24%,浸膏中平均氮质量分数w(N)=11 05%。

蚂蟥野生和人工养殖越冬亲本规模化繁殖研究

目的:通过对蚂蟥野生亲本和人工养殖越冬亲本的繁殖研究,为蚂蟥人工规模化繁殖提供参考。方法:分别以春季收集的野生蚂蟥和人工养殖越冬蚂蟥为亲本,以壤土为基质,在室外开展人工规模化繁殖试验,统计蚂蟥亲本繁殖成活率、体质量回收率、相对产茧率、平均产茧数、卵茧规格和卵茧孵化率等指标,并分析人工养殖蚂蟥越冬密度对繁殖效率的影响。结果:野生蚂蟥有效繁殖亲本2644.83 kg,投放密度5.00 kg/m^(2),产茧577.50 kg,相对产茧率21.84%,繁殖成活率78.81%,亲本体质量回收率42.74%,平均产茧数2.64枚/尾,卵茧孵化率98.00%;人工养殖蚂蟥越冬亲本低密度(3.87 kg/m^(2))、中密度(4.97 kg/m^(2))、中高密度(6.07 kg/m^(2))和高密度(7.13 kg/m^(2))的亲本体质量回收率分别为30.40%、28.19%、30.84%和28.69%,繁殖成活率分别为76.68%、74.03%、76.63%和69.05%,卵茧孵化率均≥98.00%,各密度之间亲本体质量回收率、繁殖成活率、卵茧规格和卵茧孵化率差异不显著,中高密度亲本平均产茧数(2.75枚/尾)最高,与低密度和中密度之间差异显著(P<0.05)。结论:蚂蟥人工养殖越冬亲本与野生亲本繁殖效果相近;初冬季人工繁殖蚂蟥价格较便宜,质量可靠,越冬繁殖应用前景广阔。建议人工养殖蚂蟥越冬繁殖密度控制在6.10 kg/m^(2)左右,成活率和产茧效果较好。

宽体金线蛭与菲牛蛭抗凝血酶活性及抗凝机制比较研究

目的:比较宽体金线蛭和菲牛蛭抗凝血酶活性及对凝血途径的影响,为进一步揭示水蛭抗凝作用机制提供参考。方法:采用凝血酶滴定法、发色底物法-萃取-HPLC联合法测定水蛭对凝血酶的作用;同时采用凝固法测定其活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT),比较宽体金线蛭与菲牛蛭对不同凝血途径的影响。结果:凝血酶滴定法的结果表明,不同水蛭的抗凝活性顺序依次为:菲牛蛭活体冻干品>菲牛蛭清水吊干品>>宽体金线蛭清水吊干品;发色底物法-萃取-HPLC法测定不同水蛭对凝血酶抑制作用的结果表明:不同水蛭水提取物对凝血酶的作用均表现出低浓度促进,高浓度抑制,且菲牛蛭具有强烈凝血酶抑制活性,而宽体金线蛭在加入更高剂量时才表现出抑制作用,且抑制作用较弱,菲牛蛭的抗凝血酶活性远远高于宽体金线蛭;不同水蛭样品均使APTT、PT、TT延长,但是菲牛蛭活体冻干品主要延长TT,清水吊干品主要延长APTT,而宽体金线蛭使APTT、TT延长更加显著。结论:宽体金线蛭和菲牛蛭对凝血酶及凝血途径的作用很大区别。

水蛭提取物结肠迟释微丸与普通微丸的抗血栓作用比较

目的比较水蛭提取物结肠迟释微丸(colon delayed-release pellets,CDP)和水蛭提取物普通微丸(regular pellets,RP)的抗凝血和抗血栓形成作用。方法采用毛细管法检测新西兰兔凝血时间,考察CDP和RP对大鼠动-静脉旁路血栓、狭窄法诱导的下腔静脉血栓和三氯化铁(FeCl_3)诱导颈动脉血栓形成的作用。凝血时间测定实验为单次给药,设3个组:正常组,CDP组(64 mg·kg^(-1)·d^(-1))和RP组(43.7 mg·kg^(-1)·d^(-1));动-静脉旁路血栓实验为单次给药,设6个组:模型组,CDP低、高剂量组(87,174 mg·kg^(-1)·d^(-1)),RP低、高剂量组(59.4,118.8mg·kg^(-1)·d^(-1)),阿司匹林组(7.8 mg·kg^(-1)·d^(-1));狭窄法诱导大鼠下腔静脉血栓实验设8组:假手术组,模型组,CDP低、高剂量组,RP低、高剂量组,阳性药华法林组(2.0 mg·kg^(-1)·d^(-1))和活血通脉胶囊组(312.5 mg·kg^(-1)·d^(-1)),每天给药1次,连续给药7 d;FeCl_3诱导颈动脉血栓实验为单次给药,设8组:假手术组,模型组,CDP低、高剂量组,RP低、高剂量组,阳性药氯吡格雷组(30 mg·kg^(-1)·d^(-1))和活血通脉胶囊组。称量动-静脉旁路血栓湿重和干重以及静脉血栓质量和长度,计算血栓形成抑制率;对动脉血栓进行半定量病理学分析,计算血栓形成百分比和血栓形成抑制率。结果与正常组比较,CDP组和RP组分别在给药后4 h和0.5 h显著延长新西兰兔凝血时间(P<0.05),抗凝作用分别维持4 h和1 h。CDP组和RP组能剂量依赖性抑制大鼠动-静脉旁路血栓和下腔静脉血栓形成,抑制动脉血栓形成,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。此外,在抑制大鼠动-静脉旁路血栓和下腔静脉血栓作用上,CDP强于RP。结论 CDP抗血栓形成作用显著优于RP,且CDP抗静脉血栓的作用比抗动脉血栓明显。

宽体金线蛭抗氧化活性肽的分离纯化及体外活性研究

采用三水平四因素的正交试验,用木瓜蛋白酶酶解,以肽含量为指标确定了宽体金线蛭最佳酶解工艺,即加酶量7 500 U·g-1底物,酶解温度40℃,料液比1∶4（m/V）,酶解时间4 h,最初p H 8.5;测定了酶解原液及其经CM Sepharose FF分离纯化后活性较强部分清除ABTS自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基的活性。结果显示,宽体金线蛭短肽有较高的抗氧化活性,尤其经CM Sepharose FF分离纯化后的组分清除ABTS、羟基自由基活性明显强于抗坏血酸,但其清除超氧阴离子自由基活性较抗坏血酸弱。收集合并经CM Sepharose FF分离后活性强的部分,用Sephadex G-25脱盐,Q-TOF检测,抗氧化活性肽分子量大多为130.96~330.34 u。

烫水蛭(蚂蟥)配方颗粒的位点特异性PCR鉴别

目的:为保障临床用药的安全性和有效性,建立烫水蛭(蚂蟥)及其加工制品混伪、掺假特异性聚合酶链式反应(PCR)鉴定方法。方法:根据烫水蛭(蚂蟥)细胞色素C氧化酶Ⅰ(COⅠ)基因序列设计引物,筛选出烫水蛭(蚂蟥)的稳定引物区间;在区间内筛选获得烫水蛭(蚂蟥)的特异性单核苷酸多态性(SNP)位点,并设计烫水蛭(蚂蟥)特异性鉴别引物TSZ-F、TSZ-R;分别收集烫水蛭(蚂蟥)及其阴性样品,建立烫水蛭(蚂蟥)配方颗粒特异性PCR鉴别方法,并对PCR体系进行优化,对该方法的耐受性和适用性进行考察。结果:当退火温度为54℃、循环数为34次,烫水蛭(蚂蟥)及其配方颗粒经PCR和凝胶电泳后,可在约133bp处观察到单一明亮的特异性鉴别条带,伪品无条带。结论:建立的特异性PCR鉴别方法可准确鉴别烫水蛭(蚂蟥)饮片、标准汤剂冻干粉、配方颗粒,也为可其中药配方颗粒的质量标准研究提供参考。

采收期不同体重蚂蟥内在品质及越冬前后性腺发育的研究

目的:探究采收期不同体重蚂蟥内在品质及越冬前后性腺发育的情况,为实际生产中蚂蟥的采收和繁育提供依据。方法:选择11月中旬(采收期)体重为1~3g、3~5g、5~7g、7~9g、9~11g、11~15g和15g以上共7个规格健康蚂蟥,分别测定性腺指数和内在品质等,并通过石蜡切片观察采收期及出冬眠后生殖细胞的发育情况。结果:采收期蚂蟥性腺指数随体重呈先升高后降低趋势,雄性腺指数3~5g时最高,雌性腺指数7~9g时最高。采收期的蚂蟥抗凝血酶活性与体重呈正相关。采收期5~11g蚂蟥精巢中精细胞的占比显著升高,5g以上蚂蟥卵巢内卵黄细胞期细胞显著升高。出冬眠后蚂蟥精巢和卵巢生殖细胞均发育成熟,与体重无显著相关性。结论:采收期蚂蟥体重与性腺发育具有一定相关性,而出冬眠后性腺发育与体重无相关性,建议采收时应挑选11g以上的蚂蟥,体重较小的蚂蟥留下越冬,待进一步发育成熟后作为种蛭使用。

饥饿再投喂对宽体金线蛭的生长、消化酶及抗氧化酶活性的影响

目的:研究不同饥饿再投喂方式对宽体金线蛭幼蛭生长、消化酶及抗氧化酶活性的影响,为其适宜养殖投喂策略提供参考。方法:选用平均体重为(0.094±0.01)g的幼蛭为研究对象,处理方式为饥饿7、14、21 d,再分别恢复投喂23、16、9 d,养殖周期均为30 d。结果:宽体金线蛭幼蛭饥饿7 d恢复投喂后,除增重率外,其他生长指标与对照组无显著差异,随着饥饿时间的延长,幼蛭补偿生长现象逐渐消失。饥饿14 d,幼蛭淀粉酶活性显著高于对照组(P<0.05)。饥饿7 d,幼蛭脂肪酶活性显著高于对照组(P<0.05)。经恢复投喂,各组幼蛭消化酶活性与对照组均无显著差异。饥饿7 d,幼蛭各抗氧化酶活性(SOD、CAT、MDA、GPx)与对照组之间无显著差异。长期饥饿对幼蛭的抗氧化酶活性存在显著影响(P<0.05),幼蛭饥饿21 d,经短期再投喂,其抗氧化酶活性(SOD、CAT、GPx、T-AOC)仍显著高于对照组(P<0.05)。结论:在该实验条件下,幼蛭饥饿7 d后恢复投喂,其具有完全补偿生长效应,但随着饥饿时间的延长,其补偿生长效应逐渐消失,且幼蛭体内强烈氧化还原反应短时间内无法消除。

仿生提取法研究蚂蟥不同部位体外抗凝活性

为研究蚂蟥各部位的抗凝活性,分别采用生理盐水提取法和仿生提取法提取蚂蟥内脏、肌肉、吊干品中的抗凝活性成分,以凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、抗凝血酶活性为指标进行抗凝测定。对比发现,采用生理盐水提取时,内脏的TT和APTT两种指标结果均大于肌肉和吊干品,而三者间的PT指标和抗凝血酶活性实验结果均显示没有显著性差异。采用仿生提取时,在TT指标测定和抗凝血酶活性实验中,内脏的抗凝活性低于肌肉和吊干品,在APTT指标测定中,内脏与肌肉和吊干品相比,具有较强的抗凝活性,在PT指标测定中,各部位抗凝活性没有显著性差异。仿生提取法由于模拟蚂蟥口服后在体内消化过程,因此较生理盐水提取更具有科学性。由此得出蚂蟥各部位针对不同的凝血途径,其抗凝活性具有一定的差异,抗凝物质基础较为分散。

基于分子模拟技术筛选宽体金线蛭抗凝活性肽

目的:采用分子模拟技术从宽体金线蛭来源多肽库中筛选抗凝活性多肽,结合分子对接初筛及分子动力学模拟复筛,最终通过抗凝实验验证得到宽体金线蛭抗凝活性多肽。方法:利用虚拟酶切技术对宽体金线蛭蛋白库进行酶切,得到宽体金线蛭多肽候选库;选择凝血酶为凝血活性靶点,采用HPEPDOCK及Discovery Studio CDOCKER两种方法进行分子对接,并利用分子动力学模拟技术对分子对接初筛结果中对接结合能高的复合物进行动力学模拟复筛,通过MM-PBSA模块分析计算凝血酶-多肽复合物结合自由能;最后采用固相合成法化学合成复筛中稳定结合的宽体金线蛭多肽并进行体外抗凝活性测定。结果:经过虚拟酶切共得到3317条无毒多肽,通过分子对接进行初筛,结合分子动力学模拟复筛,得到1条结合凝血酶效果最好的目标抗凝肽,该多肽序列为QNTVGLDDFFSSYER,结合自由能为-427.506 kJ·mol^(-1)。凝血酶Arg233残基是该凝血酶-多肽复合物中介导结合相互作用的关键氨基酸。该宽体金线蛭抗凝肽在体外活性测定中确能延长凝血酶时间。结论:利用分子模拟技术有效筛选出1条宽体金线蛭抗凝活性肽,并经过抗凝实验验证,表明“模拟+实验”的活性肽筛选策略切实可行,该研究思路可为动物类中药物质基础研究提供参考。